螢光實時定量PCR 技術(real-time quantitative PCR，qPCR) 幾乎是現代分子生物學技術中最重要、應用最廣泛的核酸定量檢測技術。成功的定量PCR 實驗離不開精準的實驗設計和操作流程。
實時螢光定量PCR分析的部分實施需要經過優化以確保所有反應參數均設置精確，從而獲得準確的結果。常見熒光定量PCR困難包括引物、探針、反應抑制和軟件分析等幾個方面，本篇主要為大家分享引物和探針方面的經驗。
引物二聚體的形成是最常見的問題之一。引物對之間的部分序列存在同源性時，可形成引物二聚體。如果在PCR 反應過程中引物退火形成二聚體，則Taq DNA 聚合酶可延伸二聚體，形成長於原始引物的產物，它可導致循環過程中更易出現退火錯誤。
Q：引物二聚體會引發什麼問題？
引物二聚體對反應的影響在很大程度上取決於反應中採用的化學物質。基於螢光探針的反應受引物二聚體的影響不是很大，這是由於在引物二聚體區域極少出現探針退火及斷裂的現象。此時，引物的競爭作用是需要考慮的主要問題。基於雙鏈DNA 結合染料的反應受引物二聚體的影響很大，由於染料的結合方式為非特異性的，由此可導致反應過程中監測到的螢光信號增強。這可相應改變Ct 值，使結果出現偏差。
Q：怎樣確定是否存在引物二聚體？
凝膠電泳是顯示引物二聚體的一種極佳的方法。引物二聚體在凝膠的底部形成擴散條帶，通常位於100 bp 以下。單獨採用凝膠電泳分析進行驗證的缺點在於，其靈敏度最低僅達到納克級，因此可能無法得出結果。
熔解曲線也是一種顯示引物二聚體的放法。如果擴增具有極好的特異性，則實時熒光定量PCR 板上每個反應孔的解離曲線將出現一個較窄的單峰。引物二聚體的螢光強度較低，呈較寬的「波形」，顯示其在70 °C 左右熔解（見圖1.）。
圖1. 熔解曲線中突出顯示了引物二聚體效應
Q：怎樣設計和優化實驗避免出現引物二聚體？
最好在引物設計階段就採取簡單的預防措施，從一開始即避免二聚體的形成。如果出現了引物二聚體，有許多方法可以減少或消除反應中的引物二聚體。
- 首先是優化熱循環條件，這主要是提高退火溫度。大多數情況下，兩步循環（由95 °C 變性步驟直接進入60 °C 退火和延伸步驟）有利於強效擴增，因此引物設計時設定的成功退火溫度為60 °C。
- 可降低引物濃度，甚至採用不同的正向引物和反向引物的比值也有一定的幫助。大多數情況下，每條引物的理想最終濃度為200 nM，但如有需要，可將濃度降至60 nM。
- 鎂的最佳濃度一般約為3 mM。高於此濃度易形成引物二聚體。
- 如果未對引物形成二聚體的傾向進行評估，則應補充評估並考慮重新設計（如有需要）。通常情況下，最好使用熱啟動DNA 聚合酶，並在冰上進行反應。
- 在理論上，針對同一靶點應同時檢測多個引物組。這實際上可以節省大量時間，因為如果這些引物中的一個能立即發揮作用，則可以減少花費在優化過程上的時間。
引物和探針儲存不當可導致降解及特異性喪失，進而對反應效率造成影響。影響引物和探針的穩定性的主要因素是儲存溫度、儲存時間、是否被長時間曝光、儲存的引物和探針的濃度以及儲存溶液的組分。
Q：如何長期保持引物和探針的穩定性？
保持引物和探針的穩定性的關鍵有四點。低壓凍乾的引物在儲存時間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解，即應置於-20 °C保存，且若保存時間超過一年則應對其進行監測，看它是否出現功能下降。對於標記的引物和探針，則應採取措施避免標記物曝光（例如使用不透明管及置於暗處保存），以延長它們的使用壽命。
引物濃度也可影響其穩定性。建議引物的儲存濃度不低於10 μM；實際上，在大多數情況下，100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應分裝保存，以減少凍融次數，特別是標記的引物和探針。最後，TE 緩衝液可形成比水更為穩定的環境。此外，含有0.1 mM EDTA 的TE 緩衝液（標準TE 中含有1 mM EDTA）是一種理想的溶液，這是由於一些PCR 反應對EDTA 的靈敏度可能有一些殘存。
當引物二聚體形成時，如果使用與DNA 雙鏈結合的染料，在NTC 反應中也可觀察到螢光信號。也存在另一種情況，在存在污染物的情況下，無論是基於探針還是雙鏈DNA 結合染料的反應，引物二聚體的擴增也會在NTC 孔中被觀察到。這可能是一種隨機事件，並不是所有NTC 都會出現擴增，通常是由不常見的加樣錯誤引起。如果在每一個NTC 反應裡都出現擴增，很可能是其中一種或兩種試劑被污染了。
Q：如何防止或去除污染？
- 使用乾淨的工作台，用帶核酸降解試劑的的溶液擦抹工作檯面。
- 用帶dUTP 和UDG 的反應預混液降解來自前序PCR 反應的產物，防止前序PCR 反應的污染。
- 用新的反應管盡量通過置換不同來源的試劑，發現出現問題的試劑。
- 在條件允許的情況下，在不同的實驗地點建立反應，尤其是當應用質粒作為對照時（質粒可以被很容易擴散並且難以去掉）。
實時熒光定量PCR 分析優化過程確實需要時間，但是所花的時間是值得的。這樣得出的分析結果不僅具有最高的靈敏度和最大的動態範圍，而且準確度高、效率高、重複性好，為實驗提供可靠的數據。
文章來源：賽默飛
題圖來源：站酷海洛
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