蛋白質純化是指從一個複雜的混合物中分離出一個單一類型蛋白質的一系列處理程序，蛋白質的純化對於蛋白質的功能、結構和交互作用等的特性的確認是非常重要的。如果你曾用 His-tag 做蛋白純化，或多或少有這樣的經歷：蛋白純度低、純化出來的蛋白失去原有結構、功能受到影響、難以從哺乳類細胞表達系統中純化出目標蛋白。這點，中國科研人員有不同的見解，我們一起聽聽「生物學霸」怎麼說～
作為一個孜孜不倦積極進取的人，我覺得在實驗之前得先多做做功課，於是跑到隔壁實驗室向師兄請教。師兄跟我說 Strep-tag 系統具有純化過程溫和，目標蛋白純度高，且相容於多種表達系統的特性，愈來愈受到大眾的歡迎。但是，對於 Strep-tag 這個純化系統是怎麼發展起來的，為什麼蛋白純度高，很多人可能不知道，而這點得從功能性抗體開始說起……
一、功能性抗體的出現
隨著生物製藥技術的發展，抗體也因此成為科學家研究的熱門領域。但在 80 年代初，功能性抗體的表達一直是個問題，酵母表達系統中表達出來的蛋白只有部分具有功能，在其他的微生物表達系統中，也沒有成功的先例。
一直到 80 年代末，一個具有功能性的 McPC603 抗體的 Fv 片段終於成功的在 E.coli 被中表達出來「1」。這一方法的出現，使得科學家能更快速的表達具有不同基因變異的抗體片段，並能對這些變異所引發功能改變進行檢視。
二、抗體純化不簡單
將重組抗體片段表達出來之後，必須將此片段純化出來，當時多以親和層析法搭配目標抗體的抗血清（antiserum）進行蛋白純化，但這一方法常常受到限制：在研究一個未知目標蛋白時，常出現沒有抗血清或是相容抗體的情況，這嚴重影響了實驗進度。為此，科學家嘗試找出更有效的一步純化法。
首先，他們考慮在重組蛋白上加入短肽標籤（tag），當時市面上已有 myc、flag、KT3 epitope 等標籤，但這些主要適用於偵測目標蛋白，純化蛋白效果非常有限，或非常昂貴。
隨著 His-tag 的問世，讓固定化金屬離子親和層析法（Immobilized Metal Affinity Chromatography, IMAC）純化目標蛋白變為可能，這的確提高了蛋白純化的效率。
但是His-tag 僅適用於純化，無法用於偵測目標蛋白，而且使用His-tag 進行Fv 片段純化時，高鹽濃度常使得Fv 片段解離成兩個單體（VL 及VH），難以保持抗體的功能性及正確結構「2」。
三、更高能的短肽標籤呼之欲出
要解決這些問題，科學家需要找出一個具備以下功能的短肽標籤：
1. 能被融合到目標蛋白上，且不會影響蛋白功能
2. 能直接以現有試劑偵測出來
3. 與配體結合穩定、特異性高且容易控制
經過一番搜索，發現鏈黴親和素（Streptavidin）在特定情況下，能與不同短肽進行可逆性的結合，再加上其與生物素（biotin）極高的親合力，且與背景蛋白的非特異性結合機率低，鏈黴親和素已被應用在許多檢測系統中，甚至能做為一個穩定的介質來固定蛋白。又因為鏈黴親和素在不同溶液條件中穩定性好，較抗體來的高，所以能夠重複被利用。
因此，90 年代初，科學家開始尋找一個能與鏈黴親和素特異性結合的親和標籤「2」。
四、終於找到了第一代 Strep-tag 系統 Strep-tag vs Streptavidin
因先前已知可用E.coli 系統表達出具有功能性的Fv 片段來「1」，科學家又希望能確認標籤是否會影響蛋白功能，所以選擇了已知的D1.3 抗體Fv 片段做為實驗模型，以便檢測加上的短肽標籤是否影響了這片段與其抗原結合的特性「3」。
接著，一連串能與鏈黴親和素結合的標籤被接到VH domain 上，大量篩選之後，得到了一個適用於進行一步純化的Strep-tag（Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly -Gly）「3」，與生物素相比，Strep-tag 和鏈黴親和素間的親和力較低，因此可以使用生物素衍生物Diaminobiotin，進行在生理條件下的溫和洗脫。又因整個純化流程溫和，含鹽濃度低，純化出來的 Fv 片段完整且功能不受影響「3」。
除此之外，這個標籤還能被應用在 Western blot 或 ELISA 實驗中，以鏈黴親和素酶偶聯物（Streptavidin-enzyme conjugates）來檢測純化出的 Fv 片段。後續測試了以 Strep-tag 來純化抗體以外蛋白的可能性，證實了這個一步純化系統可以被廣泛使用在不同類型的蛋白上「3」。
五、因為不完美，所以有了第二代 Strep-tag II vs Strep-Tactin®
但 Strep-tag 僅能接在目標蛋白的 C 端，對於需將標籤接在 N 端或是蛋白內部的實驗，非常的不實用。因此科學家進一步優化了這個標籤，便有了現在被廣泛使用的 Strep-tag II（Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys）「4」。
但即便足以用於蛋白純化，科學家對 Strep-tag II 與鏈黴親和素的結合強度低這點仍不甚滿意，因為在比較特殊的純化條件中效率會受影響。於是進行了鏈黴親和素的改造，發展出 Strep-Tactin®。
Strep-Tactin®:Strep-tag II 的親和力較 Streptavidin:Strep-tag II 提升了近 100 倍，這個改變使得洗脫時需改用脫硫生物素（Desthiobiotin）「5」，但過程一樣溫合。這就是二代 Strep-tag 系統，在過去近 20 年間，逐漸被廣泛應用於純化或偵測蛋白質中，還甚至發展出細胞分離檢測的方法「6」。
六、總覺得還能更好，一起看看第三代 Twin-Strep-tag vs Strep-Tactin®XT
即便親和力已提升，在某些狀況下，Strep-Tactin® 使用仍有所限制，尤其是在需要極高親和力的應用之中，例如檢測蛋白質間的交互作用、或是從目標蛋白濃度低的樣本中進行純化。
因此科學家利用總結合力（Avidity）的原理，將兩個 Strep-tag II 以 linker 連接在一起：Twin-Strep-tag）「7」。這一新標籤的出現再度提升了目標蛋白與Strep-Tactin® 的鏈接強度，改善了低濃度樣本純化效果「8」，還能於抓取蛋白複合體、檢視蛋白間的交互作用「7,9 」。
美中不足的是，Strep-Tactin® 在變性條件下並不穩定（例如：使用尿素時），無法進行純化，且進行批量純化時，即使搭配 Twin-Strep-tag，效果仍有改善的空間。為此，科學家再次改造了 Strep-Tactin®，得到與 Twin-Strep-tag 親和力更上一層樓的 Strep-Tactin®XT（XT 意指 extreme tight）「10」。
經過這次的優化，科學家首次創造出一個純化系統，其中標籤與配體的鍵結力幾近共價，但鏈結仍保持可逆（注：Strep-tag II 也能與Strep-Tactin®XT 結合）。因親和力的增加，即使經過多次清洗步驟，蛋白也不會從 Strep-Tactin®XT 上解離，提高了目標蛋白的得率。
需注意的是，洗脫步驟必須使用生物素，但是整個純化流程與前幾代一樣溫合，純度超過 95%，這就是最新一代 Strep-tag 系統。用Strep-Tactin®XT 來純化時，得率及純度都提高；且Twin-Strep-tag 搭配後還能用在Biacore 芯片「11,12」、微量滴定板或ELISA 中來固定蛋白，進行後續檢測，是一個多用途的親和標籤系統。
參考文獻
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3.Schmidt TG & Skerra A（1994）J Chromatogr A., 676, 337-45.
4.Schmidt TG, Koepke J, Frank R & Skerra A（1996）J Mol Biol., 255, 753-66.
5.Voss A & Skerra（1997）Protein Eng., 10, 975-82.
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9.Ivanov KI, Bašić M, Varjosalo M & Mäkinen K（2014）JoVE, 86, 51536.
10.Carl U（2016）Poster session presented at: PEGS Bosten 2016.
11.Dintner S, Heermann R, Fang C, Jung K & Gebhard S（2014）J Biol Chem., 289, 27899-910.
12.Yeliseev A, Zoubak L, Schmidt TGM（2017）。 Protein Expr Purif., 131, 109-118.
作者：IBA
圖片來源：IBA
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