哺乳動物細胞表達的難點和解決方案,都幫你整理好了

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雖然大腸桿菌E.coli 表達系統經濟實惠,但由於缺乏重要的脂類,分子螫合物,以及重要的翻譯後修飾,用它表達真核蛋白,可能會影響蛋白本身的折疊及功能,以膜蛋白為例,大腸桿菌表達系統能影響目標蛋白在細胞膜的插入位置、及其應有的功能[1]。除此之外,當目標蛋白大於 50kDa 時,使用大腸桿菌系統可能表達出不完整的蛋白[2]。

 

先前已經提到 Strep-tag® 的歷史(點此回顧),現在我們將著重介紹 Strep-tag® 在哺乳類細胞表達系統的應用。

雖然大腸桿菌E.coli 表達系統經濟實惠,但由於缺乏重要的脂類,分子螫合物,以及重要的翻譯後修飾,用它表達真核蛋白,可能會影響蛋白本身的折疊及功能,以膜蛋白為例,大腸桿菌表達系統能影響目標蛋白在細胞膜的插入位置、及其應有的功能[1]。除此之外,當目標蛋白大於 50kDa 時,使用大腸桿菌系統可能表達出不完整的蛋白[2]。

所以,為了研究特定蛋白的功能(如:信號通路)、生產較大型的蛋白,或進行高解析度的結構分析,愈來愈多的實驗組選擇哺乳類表達系統來生產融合蛋白。其原因為哺乳動物細胞生產出的重組蛋白與人類蛋白十分相似,有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯後修飾[3]。因此,愈來愈多科學家們更加關注於—如何從哺乳類細胞中高效的純化目標蛋白。

 

親和標籤的選擇

首先,需考慮選擇合適的親和標籤。常用於哺乳動物表達系統的親和標籤有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag® 等[4-12],整理於下表:

 

這些親和標籤在使用上各有千秋。

使用 His-tag 時,常遇到的問題是寄主蛋白與填料的非特異性結合,在哺乳動物重組蛋白的純化過程中,這樣的情況更為明顯。由於系統中有很多含有組氨酸(histidine)的殘基的蛋白,這種蛋白結構與 his-tag 相似,容易與鎳柱結合,因此導致目標蛋白純度降低[13]。

FLAG-tag 系統可在非變性條件下進行純化,能得到高純度、有活性的蛋白,但其缺點為純化介質較為不穩定,且純化成本高上許多[5]。

另一常用的標籤為GST-tag,一個26kDa 的蛋白,其特點是表達量高,具高度抗原性,常用來增加目標蛋白的溶解度,但常常會影響目標蛋白的特性,一般推薦純化後將標籤去除[8]。

而Strep-tag®(包含Strep-tag®II或是Twin-Strep-tag®),都是短肽標籤,分別為8 或28 個胺基酸,一般不干擾蛋白折疊或活性,因此適合用於蛋白功能性研究[5]。 Strep-tag® 可以特異性的結合在 Strep-Tactin® (二代介質) 或 Strep-Tactin®XT (三代介質) 的生物素的結合位點。洗脫時使用的脫硫生物素(適用於二代)或生物素(三代),對同樣的結合位點有更高的親和力,能將目標蛋白從同樣位置移除,因此得到的目標蛋白純度一般高於95%[12]。

同時,三代Strep-Tactin®XT 與Strep-tag® 蛋白的親和力大幅提升,直接加入含目標蛋白的哺乳細胞的培養上清,即可高效純化出所需蛋白(注: 原本使用二代需先以Avidin 或是BioLock 將培養基中的生物素遮蔽,才不會影響純化表現)。

 

三代 Strep-Tactin®XT 親和力顯著

圖 A 比較了 His-tag 與 Strep-tag® 直接加入哺乳細胞培養上清純化目標蛋白的表現。

 

圖A:分別向Strep-Tactin®XT High Capacity 1ml 重力柱(左)和Ni-NTA 1ml 重力柱(右)中,同時加入含4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或mCherry-His-tag (His) 螢光蛋白的ExpiCHO 細胞培養上清(注: 接下來的實驗皆是取哺乳細胞表達某抗體後的上清,另加入高純度目標蛋白進行實驗)。由圖可見,Strep-Tactin®XT(左)能高效率的捕捉 mCherry-TST,而右方的 mCherry-His 幾乎無法掛柱。

此外,我們也測試了其他的蛋白,例如 SEAP (72 kDa) 或抗體 (mAb,其重鍊為 55 kDa)。圖 B 為以 Strep-Tactin®XT 純化 SEAP-TST、mCherry-TST與 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析結果,可見對於不同蛋白,Strep-tag® 系統都能純化出高純度的目標蛋白。 (注: 紅色標記處為 mCherry 的降解產物,非雜帶)

圖B

因 Strep-Tactin®XT 與 Twin-Strep-tag 蛋白的高親和力,即使目標蛋白的濃度低,使用 Strep-Tactin®XT 仍可以有效的捕捉上清中的目標蛋白。表 C 整理了幾個實驗的數據,顯示當目標蛋白濃度低於 20 μl/ml 時,得率仍能達到幾近 100%。

表C


Strep-Tactin®XT 普適性高

除了上述實驗所用的 CHO 細胞株外(中國倉鼠卵巢細胞),另一常用於生產蛋白的哺乳動物細胞株為 HEK293(人胚胎腎細胞),使用上較 CHO 簡單。我們測試了 Strep-Tactin®XT 的純化表現 : 表 D1 為以 Expi293 表達 SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白後,目標蛋白的濃度。圖 D2 為純化表現的 SDS-PAGE 分析。從中可知,與 ExpiCHO 培養基相同,直接將表達好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin®XT 高載量重力柱中進行純化,一樣能夠快速的得到高純度的目標蛋白。

表D1

圖D2

綜上所述,Strep-tag® 非常適合用在哺乳動物細胞系中表達目標蛋白,其純化過程也與常見的 ExpiCHO 及 Expi293 培養基相容,不須另外處理,讓實驗流程更為便利。加上 Strep-tag® 系統在純度上的優勢,是目前在這個應用上的絕佳選擇。

 

參考文獻

1. Sahdev S, Khattar SK, Saini KS (2008). Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems: a review of the existing biotechnology strategies. Mol Cell Biochem., 307(1-2):249-64

2. Dyson MR, Shadbolt SP, Vincent KJ, Perera RL, Mccafferty J (2004). Production of soluble mammalian proteins in Escherichia coli: identification of protein features that correlate with successful expression. BMC Biotechnol., 4:32. doi: 10.1186 /1472-6750-4-32

3. Khan KH (2013). Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications. Adv Pharm Bull., 3(2): 257-63. doi: 10.5681/apb.2013.042

4. Wegner GJ, Lee HJ, Corn RM (2002). Characterization and optimization of peptide arrays for the study of epitope-antibody interactions using surface plasmon resonance imaging. Anal Chem., 74(20):5161-8.

5. Terpe K (2003). Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl.Microbiol.Biotechnol.,60(5): 523-33. doi: 10.1007/s00253-002-1158-6

6. Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S (2005). Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif., 41(1):98-105.

7. Tessema M, Simons PC, Cimino DF, Sanchez L, Waller A, Posner RG, Wandinger-Ness A, Prossnitz ER, Sklar LA (2006). Glutathione-S-transferase-green fluorescent protein fusion protein reveals slow dissociation from high site density beads and measures free GSH. Cytometry A., 69(5):326-34.

8. Kimple ME, Brill AL, Pasker RL (2013). Overview of affinity tags for protein purification.Curr Protoc Protein Sci., 73: Unit 9.9. doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73.

9. GE Healthcare (2016). Affinity Chromatography Handbook, Vol. 2: Tagged Proteins.

10. Thermo Fisher Scientific (2015). Protein Expression Handbook

11. Dynamic Biosensors (2018) Application Note: High-affinity capturing of tagged proteins on the switchSENSE® biochip using Strep-Tactin®XT.

12. IBA Lifesciences (2016) Application Note: Strep-Tactin®XT:Twin-Strep-tag®- Advantages compared to the His-tag purification system.

13. Bornhorst JA, Falke JJ (2000). Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol., 326:245-54.

題圖來源:shutterstock 正版圖庫

圖片來源:iba

文章來源:iba

生物學霸

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生物學霸

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