RNA 測序如何做好樣本質控，單看 RIN 值就足夠了嗎？為什麼有的時候 RIN 值挺高的，但有些位點卻怎麼也測不到？研究小 RNA 的差異表達時是否可以參考 RIN 值？針對這些 RNA 測序應用中經常遇到且困擾大家的問題，經驗豐富的華大科技在 18 年夏天的直播課程中結合文獻與華大的經驗給大家做了精彩的分享。經由華大許可，我們將直播課程中的精華部分組織成了文字內容與大家分享。
講師：宗亮，華大科技技術優化高級工程師，主要負責 RNA 測序技術的工藝優化及 Troubleshooting、自主測序平台的技術轉移和技術支持。著有 SCI 文獻一篇，發明專利四項。
RNA 完整性常用參數 RIN 值
RIN 值是安捷倫公司開發的以數字化形式表示 RNA 完整性的參數。
• RIN 值相比核醣體 18S:28S 的結果可信度更高
• RIN 值反映總 RNA 的完整性，與樣本濃度無關
• RIN 是基於以人、小鼠、大鼠為代表的哺乳動物開發的
RIN 值比 18S:28S 更可靠，不受樣本濃度的影響。圖中原始樣本的核醣體 CV 為 5.1%，RIN 值為 8；將樣本梯度稀釋後，核醣體 CV 變為 22%，而 RIN 仍為 8，說明 RIN 值的穩定性明顯優於核醣體比值。
RNA 的質量受多因素的影響
• Ambion 的操作手冊中講到，RNA 的完整性對 GLOBIN 清除步驟以及下游應用的成功至關重要，即使是中等水平的 RNA 降解也會導致捕獲試劑在清除球蛋白 mRNA 時的不充分
• 血液樣本的保存、RNA 純化的方法，以及殘留 RNA 酶的活性都會影響 RNA 的質量
• Illumina 的產品手冊中要求 RIN 值要大於８，華大根據交付樣本的大數據分析，建議交付的樣本的 RIN 值大於７（關於 RIN 值的標準，用戶可以根據現實研究經驗進行設定）
RIN 值可結合 RT-PCR 來對用於表達譜的 RNA 進行質量評估
挪威公眾健康中心為了研究如何將全國各地的樣本安全送到樣本庫而免受人為因素的干預，除了採用合適的採血管、最佳/ 次優的採血體積，同時還分析了來自全國各地樣本的表達譜差異1。
• 通過 RIN 分析總 RNA 的完整性
• 對 6 個有代表性的與癌症發生相關的基因進行 RT-PCR 分析其轉錄本的變化
• 研究的結果是 RNA 質量未受運輸過程的影響；關鍵基因的轉錄本的表達模式沒有發生顯著變化
這種通過 RIN 值檢測，結合 RT-PCR 檢測關鍵基因轉錄本的穩定性可以更全面的評估 RNA 的質量，特別是樣本是否適用於下游表達譜研究。
華大專家友情提示：當用 RT-PCR 對 NGS 基因表達變化的結果進行驗證時，需要注意三點：
1．如果使用 Oligo dT 引物做反轉錄，要同時注意樣本的 RIN 值，以及設計擴增子時注意其與轉錄本 3’端的距離
2．用於 RT-PCR 驗證的樣本盡量與 NGS 檢測用的樣本來自同一樣本管，以最大限度保證 RIN 值一致，並使用與轉錄組文庫構建時相同的逆轉錄方法
3．盡可能驗證每對引物的特異性與擴增效率，包括文獻已經報導的引物設計
融合基因檢測時除了 RIN 值，還要考慮融合位點與 3’端的距離
前段時間熱映影片《我不是藥神》中慢粒白血病的靶向藥格列衛靶向融合基因 BCR-ABL。有研究表明在 BCR-ABL 陽性患者中有不到 80% 患者同時也存在 ABL-BCR 融合。在梅奧診所的研究中，當樣本 RIN 值為 10 時，測序可以同時檢測到兩種融合產物，而當 RIN 值為 7 以下時就檢測不到 BCR-ABL 了2。
從梅奧診所的這項研究結果可以推斷出兩個融合位點距離3’端是有差異的，而事實上的確如此，BCR-ABL 距離3’端5kb，ABL-BCR 融合距離3’端只有1.5kb（圖2, b）。將整個測序數據平鋪在轉錄本上，橫坐標是融合位點與 3’末端的距離，縱坐標是覆蓋的 reads 深度。結果顯示：
• 只有當 RIN 值為 10 時，幾乎可以實現對距離 3’端 0-5kb 區域的均勻覆蓋（圖 2, c）
• 一旦 RIN 值小於 10，就很難覆蓋到距離 3’端大於 2kb 的區域了（圖 2, c）
• 圖 2, d 中，當 RIN 為 3 時，即使距離 3’端 1.5kb 的 ABL-BCR 也不能被很好的覆蓋
梅奧在研究同時指出：
• COSMIC（人癌症變異）數據庫中，目前已知的融合基因產物的融合位點距離3’端的中位數為2.7kb，大約有20% 融合位點距3’端大於5kb；5% 距3 ‘端大於7kb
• 基於梅奧的研究結論：RIN 值小於 10 時，難以測到距離大於 2kb 的融合位點。也就是說當 RIN 值小於 10 時，至少有超過 20% 的融合基因的產物無論測多少深度都是測不到的
• 融合位點的成功檢測基於兩個因素：RIN 值、融合位點與轉錄本 3’端的距離
梅奧研究的提示：在做轉錄本研究時（特指用 Poly A 釣取法研究編碼 RNA 時），RIN 值不僅能提示 RNA 的質量，同時能對測序數據做出預期。
在以 PolyA 釣取為主要技術手段研究編碼 RNA 時，RIN 只能做為評估基本樣本完整性的方法，而不能預測表達譜數據的可信度
在兩組獨立的實驗中，實驗1 將UHR（人標準參照）處理成不同RIN 值的梯度，針對不同基因位點的測序結果做散點檢測，以基因位點距轉錄本3’端的距離和檢測靈敏度（有效reads 數）分別為橫坐標和縱坐標3。結果發現RIN 值相同（7.5）的兩個不同樣本在做散點圖時，一個的曲線更擬合於RIN 值為8.6 的UHR，另一個的更擬合於RIN 值為5.9 的UHR 樣本（圖3）。實驗 2 對健康志願者的外周血分離單核細胞，在室溫下靜置不同時間（形成不同降解程度），純化後進行以 PolyA 為技術手段的轉錄組測序4。對結果進行聚類分析，維度一為處理方案，即靜置時間，維度二為樣本的 RIN 值。在聚類結果中發現，聚類依據更多的與樣本處理方案相關，而非 RIN 的差異（圖 4）。從這兩份研究中得到的結論是：
1． RIN 值可以做為基本樣本完整性的方法，但不能預測某一個特定基因的完整性，這種情況下測序數據是樣本完整性的較為客觀的反映
2．在大多數情況下 RIN 值不能預測表達譜數據的可信程度
3．表達譜數據的改變與取樣方式、保存方法，以及提取方法之間有著顯著的關係
4．研究人員最好能夠配合多種方法學的驗證，以得出更準確的實驗結論
RIN 值低的樣本也可能用於小 RNA 測序
加拿大的研究者在嚴格控制的實驗環境下（沒有核酸酶污染），以不同起始量的總 RNA 構建測序文庫；並對總 RNA 進行處理，獲得 RIN 值從 9-2 的樣本5。測序結果表明：
1． RNA 測序鑑定到的小 RNA 的數目與建庫時所用的起始總 RNA 量沒有顯著關係
2． RNA 測序數據的可利用程度（用於鑑定小 RNA）與 RIN 值沒有顯著關係
3．以全血為實驗材料時，小 RNA 具有極高的穩定性，樣本 RIN 值低也可以做小 RNA 測序，並且小 RNA 的定量結果是很可靠的
另一項研究發表在Nature Biotechnology 上，研究者在全美選擇了9 個技術過硬的實驗室，用4 家主流的RNA-Seq 試劑盒（實驗方案），對體液的小RNA-Seq 結果展開對比6 。圖 5 中，三百多條合成序列（濃度設定已知）分為 A 組和 B 組。結果顯示：
1．聚類的結果只與建庫的方法有關，如果建庫方法不同則同一實驗室同一樣本的結果也不一致
2．當只關心小 RNA 的差異表達時，最右側的結果顯示不同方法與實驗室之間具有很好的可比性
3．當以血清樣本替換合成樣本時，結果一致。說明以血清為代表的液體活檢，當只關注小 RNA 的差異表達時，結果是有很好的可重複性和可再現性的。
上述兩組實驗的結論可彙總為：
• 小 RNA 具有極高的穩定性，樣本 RIN 值低也可以做小 RNA 測序，且定量結果可靠
• 小 RNA 的檢測結果與建庫方法有關
• 當只關心小 RNA 的差異表達時，即使實驗方法、批次，甚至由不同公司開展檢測，其數據的可信度和可比性仍然很高
FFPE 樣本的質量評估
FFPE 樣本最具挑戰性。
• Illumina 推薦使用 DV200 來評估 RNA 是否可用於轉錄組測序，他們認為 DV200 大於 30%，即總 RNA 中大於 200nt 的組分佔比大於 30% 時是可以用於轉錄組測序的
針對不同完整性的 FFPE 樣本，我們可以通過選擇不同的實驗方案來實現對樣本內核酸信息的最大限度挖掘
諾華製藥生物醫學研究所針對不同樣本用量、不同降解程度，以及不同 RNA 實驗方法設計了一個宏大實驗方案，用於評價最優的建庫方案7。基本從五個維度進行了全面的評介：1. 能否產生高質量的測序數據； 2. 對於已知轉錄本是否能夠實現全長的覆蓋； 3. 能否檢出非編碼的RNA 序列（這對於醫學研究特別重要）； 4. 對於已知的基因，其定量的結果是否準確，例如與QPCR 的方法或其它的方法學的結果相比較； 5. 當使用不同的樣本量、降解程度時，其定量結果是否是可再現的（圖6）。
這篇文章的結論是：在應對不同起始量、不同RNA 完整程度的樣本時，不同的建庫方案都有各自的優缺點；但針對不同完整性的樣本，我們可以通過選擇不同的實驗方案來實現對樣本內核酸信息的最大限度挖掘。文章提到，當使用 TruSeq 的建庫方法，即使樣本只有 5ng 時，其測序結果也不錯；而對於嚴重降解的樣本，文章認為 Access 的方法可能是更好的選擇。
為篇幅所限，我們無法百分百展示華大本次課程的全部內容。在本文的結尾，我們結合了華大專家的建議與安捷倫對 RNA 質控的經驗與理解，與大家分享 RNA 質控的要點：
1． RIN 值是評價 RNA 完整性的最為廣泛應用的工具
2．在對轉錄本進行研究時，轉錄本的完整程度並不能與 RIN 值建立起直接關係，特別是針對某一條或某一些特定轉錄本時，其不相關性可能更為突出
3．在做表達譜研究時，可以將 RT-PCR 與 RIN 值結合在一起評估 RNA 的質量
4．以 Poly A 釣取方法檢測基因融合時，除了 RIN 值，還要考慮融合位點與 3’端的距離
5．小 RNA 具有極高的穩定性，樣本 RIN 值低也可以做小 RNA 測序，但檢測結果與建庫方法有很大相關性
6．實驗設計時可以根據樣本的類型、起始樣本量、完整程度等對生信方案，建庫流程進行調整以獲得最優的測序結果
文章來源：安捷倫
題圖來源：站酷海洛
參考文獻：
4. Gallego Romero I, et al. RNA-seq: Impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biol. 2014 May 30;12:42.
5. Lopez JP, et al. Biomarker discovery: quantification of microRNAs and other small non-coding RNAs using next generation sequencing. BMC Med Genomics. 2015 Jul 1;8:35.
6. Giraldez MD, et al. Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):746-757.
7. Schuierer S, et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 2017 Jun 5;18(1):442.
