6 款曲線,解決99% 的ELISA 數據擬合難題

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我們通常 ELISA實驗完成後,後面最重要的工作就是如何把 O D值轉化為濃度,以達到分析數據的目的。樣本濃度的分析是根據標準品數據所生成的標準曲線完成的。要確保樣本結果的準確性,首先就要保證標準曲線盡量能還原抗原抗體的動力學反應過程。目前,我們常用的方法是 excel 繪圖,或者用繪圖專用軟件 curve 軟件做圖。常用的函數excel 都能歸納,但是 excel 能歸納的曲線模型比較有限,而專業的 curve 軟件能擬合的回歸曲線就比較多也比較全面。所以目前專業的 curve 軟件是目前最流行的數據處理軟件之一。

我們常用的曲線擬合回歸方程主要為以下6 種:

1.直線擬合回歸方程:

直線回歸是最簡單的回歸模型, 也是最基本的曲線擬合回歸分析方法, 將所有的測試點擬合為一條直線,其擬合函數方程式為:y=a+bx

2.二次多項式擬合回歸方程:

二次多項式成拋物線狀,開口向下或者向上,在很多ELISA實驗中,擬合近似於二次多項式的升段或者降段,由於曲線的特性,同一個濃度值在曲線圖上可能表現出沒有對應的OD值、有一個OD值,或者兩個OD值,所以使用二次多項式擬合時,最好保證取值的範圍都落在曲線的升段或者降段,否則哪怕是相關係數很好也很可能與實際的值不一致。其擬合函數方程式為:y = a+bx+ cx 2,形狀如下圖:

3.三次多項式擬合回歸方程:

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三次多項式像倒狀的「S」形,在實驗結果剛好在曲線的升段或者降段的時候,效果還可以,但是對於區間較廣的情形,由於其彎曲的波動,三次方程擬合模擬不一定很好,跟二次方程擬合一樣,看曲線的相關係數的同時也要看計算的點在曲線上的分佈,這樣才算出理想的結果,本軟件計算值時,選擇性的取相對於濃度或者OD值,比較符合實際的那個結果,而沒有將多個結果列出。擬合函數方程式為:y= a+bx+ cx 2 +d x 3,形狀如下圖:

4.半對數擬合回歸方程

半對數擬合即將濃度值取對數值,然後再和對應的OD 值進行直線回歸,理想的狀態下,在半對數坐標中是一條直線,常用於濃度隨著OD 值的增加或者減低呈對數增加或者減少的情況,即濃度的變化比OD 值的變化更為劇烈。在ELISA 實驗中較常用(有很多用EXCEL 畫圖時,也常使用半對數),擬合函數方程式為:y = alg(x)+b ,形狀如下圖(注意其X 軸是對數坐標) :

5.Log-Log擬合回歸方程

Log-Log 擬合和半對數相似, 只是將OD 值和對應的濃度值均取對數,然後再進行直線回歸,擬合函數方程式為:lg(y) = alg(x)+b ,形狀如下圖:

6.Logit-Log擬合回歸方程

Logit-log 則是免疫學檢測中的模型, 可用於競爭法。它最早用於RIA, 但在ELISA 中也是可以應用的。Logit 變換源於數學中的Logistic 曲線。在競爭法放射免疫分析(RIA)及ELISA 中,當競爭性反應物為0 時結合率為100%, 如果某一濃度下結合率為B,B=OD/OD(0),在對B 進行Logit 變換:y=ln[B/(1-B)],之後y 與濃度的對數成線性關係,即:y=a+blg(x),擬合函數方程式為:lg(y) = alg (x)+b 就得到了Logit-log 直線回歸模型,這個模型一般適用於競爭法的擬合,所以擬合時要求只有少有一個零濃度測試的OD 值,並且此值為整個反應的最大值(也就是我們常說的至少要做一個空白對照)。

7.四參數擬合回歸方程:

四參數方程的擬合函數表達式為:

競爭法和夾心法都可以用到。它的形狀, 根據情況, 可能是一個單調上升的類似指數, 對數, 或雙曲線的曲線, 也可能是一個單調下降的上述曲線, 還可以是一條S 形曲線。它要求X 值不能小於0(因為指數是實數, 故有此要求)。在很多情況下它都可以擬合ELISA 的反應曲線, 所以它也成了ELISA 中應用最廣的模型之一。

切記,在實驗過程中,要根據各個實驗本身的特點,選擇最適合的曲線擬合模型,才能得到最合理的實驗結果, 一般情況下,需要綜合考慮標準曲線的趨勢走向以及R 值的大小,來最終選擇適合自己的回歸方程。

文章來源:博士德
題圖來源:站酷海洛
Photo by bruce mars from Pexels

 

生物學霸

作者

生物學霸

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