高分文章簡單做 「質譜流式」技術乾貨學一下

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流式細胞術以多參數、高分辨率以及快速檢測等優點而廣泛應用於多個研究領域及臨床診斷中,特別是免疫學研究。美中不足的是,在篩選未知細胞群時,傳統流式細胞術容易陷入「盲人摸象」的尷尬。而質譜流式技術則能完美解決這一問題,通過檢測通道方面的飛躍,目前可同時檢測40 多種指標,實現對細胞更為全面的檢測。

與傳統多色流式實驗一樣,質譜流式同樣需要「燒腦」考慮配色(panel design),在實驗前「步步精心」,正所謂一步錯,步步錯,策劃周全的實驗方案是獲得有效數據的關鍵。下面就讓我們一起揭秘質譜流式,文末更有CyTOF / Luminex 多重檢測技術交流會,現場體會質譜流式的魅力。

了解更多質譜流式原理,請查看:質譜流式,一個富二代的自白

特色同位素標記

質譜流式相對於傳統流式技術的主要差異在於使用金屬元素及其同位素作為抗體標籤,目前用作標籤的主要有稀土元素、惰性元素、後過渡金屬和鹵素,這些元素在細胞內含量少,不會引起高背景,也不會影響細胞正常的生理功能,目前用作質譜流式標籤的主要同位素如下圖所示:

通過這些標籤標記的抗體,可以檢測細胞相關生物標誌物的表達及修飾、細胞活性、細胞功能及細胞週期等。

相較傳統流式而言,質譜流式技術中相鄰通道的干擾已經降低了很多,然而溢漏現象依然存在,主要由以下幾個原因導致:

①.同位素純度不夠(Impurities)。

②. M ± 1,是指相鄰通道的溢漏,被稱為豐度靈敏度(Abundance Sensitivity),簡單說就是質量為M的峰的拖尾,在M + 1和M – 1質量上的信號干擾。

③. M + 16,是指同位素氧化導致的干擾(Oxidation)。如輕鑭系元素(139~160 AMU)因為氧化物的形成,導致了對重鑭系元素(155~176 AMU)通道產生干擾,目前通過實驗體系的優化,最容易氧化的鑭系元素同位素的干擾降低到3.0%以下。89 Y,  102 Pd,  104 Pd,  105 Pd,  106 Pd, 108 Pd,  110 Pd,  113 In, 115 In,和209 Bi同位素不會產生氧化干擾,也不會對輕、重鑭系元素產生氧化干擾。

(A)質譜流式技術干擾信號源示意圖[1]

Chevrier S 等使用單染微球計算出通道間溢漏的矩陣,可作為通道選擇的參考,如圖B 所示:

(B)基於單染微珠計算的溢漏矩陣。對角線上的值是1。默認情況下,溢漏只計算潛在受影響的通道,包括M ± 1,對應已知同位素純度,M + 16。小格中的數字表示行中的元素溢漏到列中通道的百分比。最後一列中的數字表示在相應通道中接收到的溢漏信號總量。

Panel Design 基本策略

同傳統流式一樣,針對不同表達豐度的標誌物,也遵循「強弱搭配」原則,即表達丰度高的標誌物選擇較低或中等靈敏度的同位素標籤;表達丰度低的標誌物選擇高靈敏度的同位素標籤。

表達豐度低或未知的抗原:

  • 選擇高靈敏度通道,如153–176 Ln、209 Bi;
  • 選擇不會或很少受到其他通道干擾的通道;
  • 可以考慮進一步放大信號,如使用金屬元素標記的生物素二抗或多個不同克隆號抗體標記同一指標。

表達豐度高的抗原:

  • 選擇較低靈敏度的標籤(89 Y ,  102–110 Pd ,  113 In ,  115 In)或中等靈敏度的標籤(139–152 Ln);
  • 選擇不會或很少干擾其他通道的通道;
  • 優化抗體濃度,使用滿足需求的最低抗體濃度,從而降低對其他通道的干擾。

此外,還可以遵循以下規則:

①. 互斥抗原(如CD4 和CD8)可以安排在有干擾的通道。

②.共表達抗原(如CD3和CD4)安排在互不干擾的通道。如果無法避免,可以安排下級(如CD4)影響上級通道(如CD3)。

③.設置完善的對照。除實驗必需對照外,可以設置Mass-minus-one (MMO) controls,類似傳統流式的FMO(熒光減一對照),以此判斷通道的干擾。

④.區分單細胞群和活細胞群。質譜流式儀無FSC / SSC參數來區分細胞,因此常使用銥(iridium)或銠(rhodium)的同位素作為核酸嵌入劑,根據DNA含量來識別整體細胞群、區分粘連體和碎片。化學治療劑順鉑(鉑)能夠和有損傷的細胞膜共價結合,常被用來區分死活細胞。

技術大咖面對面

由Bio-Techne 主辦的「2019 CyTOF / Luminex 多重檢測技術交流會」將在深圳舉行,邀請您與質譜流式及Luminex 多重檢測技術專家面對面,探討其技術原理、實驗設計及最新應用。

一、講師風采

付國教授,畢業於澳大利亞墨爾本大學。曾任美國Scripps 研究所Staff Scientist。目前就職於廈門大學生命科學院,研究方向為免疫細胞的功能和發育,包括T 細胞和B 細胞的發育、分化、功能及相關信號轉導,病原體和宿主的相互作用,腫瘤的免疫監視和治療等。廈門大學擁有國內首台質譜流式儀,而付國教授是國內最早接觸質譜流式技術的學術帶頭人之一,積累了豐富的經驗和研究數據,並成功在質譜流式平台上開發新的試劑和方案。郭鵬舉博士,澳大利亞墨爾本大學博士,聯邦科學與工業研究組織博士後。現任廣州維佰生物科技股份有限公司技術總監。2005~2010 年在澳大利亞聯邦科學與工業研究組織工作,從事干擾素與細胞因子對免疫系統的影響及其相應的基因調控的研究。2010 年11 月回國,先後在廣東省獸醫研究所和廣東省實驗動物監測所擔任項目負責人,從事動物健康的檢測技術,特別是Luminex 的xMAP 和xTAG 技術應用於動物健康檢測。回國後共申請國家發明專利52 項,國際PCT 專利11 項,已授權國家發明專利32 項(其中Luminex 技術相關專利17 項),發表SCI 文章32 篇(Luminex 技術相關9 篇)。

二、日程安排

三、時間地點

  • 時間:2019 年5 月26 日
  • 地點:深圳博林天瑞喜來登酒店

四、報名諮詢

  • 掃描下方二維碼,申請報名;

  • 或在生物學霸公眾號後台回复口令「c0526」,申請報名。
  • 如需諮詢,請撥打電話:021-52380373
參考文獻:
[1]. Chevrier S et al. Cell Syst. 2018 May 23;6(5):612-620.e5.
[2].Han G et al. Nat Protoc. 2018 Oct;13(10):2121-2148.
[3].Majonis, D et al. Biomacromolecules 12, 3997–4010 (2011).
[4].Behbehani GK,et al. Clin Lab Med. 2017 Dec;37(4):945-964.
[5].Laura T. Donlin, et al. Arthritis Res Ther. 2018;20:139.

文章來源:Bio-Techne
圖片來源:Bio-Techne、站酷海洛
題圖來源:站酷海洛
Image by Gerd Altmann from Pixabay

生物學霸

作者

生物學霸

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