細數腫瘤免疫研究中 5 大小鼠模型,讓你少查半個月文獻

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2013 年《Science》雜誌評選的當年十大科學突破中,癌症免疫治療研究成果位列其首!2018 年的諾貝爾生理醫學獎授予了開啟腫瘤免疫治療新航向的美國免疫學家詹姆斯 · 艾利森(James P. Allision)和日本教授本庶佑(Tasuku Honjo)!自此,人類與癌症的鬥爭進入腫瘤 – 免疫(immuno-oncology,IO)時代!

以免疫檢查點(immune checkpoint)抑製劑和 CAR-T 細胞治療為代表的新的免疫療法在臨床實踐中創造的許多奇蹟!這些研究讓人們相信癌症不再是不治之症!

雖然癌症的免疫治療研究方興未艾,但其實人們很早就認識到免疫與腫瘤的密切關係:

1. 某些腫瘤的發生由慢性炎症而起;
2. 腫瘤的發展、轉移需要逃脫免疫系統的嚴密監視;
3. 免疫細胞是構成腫瘤生長微環境的重要組分,某些免疫反應會被腫瘤細胞利用而成為促進腫瘤生長、擴散的因素,有可能在腫瘤治療,尤其是免疫治療當中發揮負面影響。

因此免疫與腫瘤的關係研究,特別是腫瘤微環境中的免疫調節機制的研究也成為當今 IO 時代的重要內涵。不管是癌症免疫治療還是腫瘤發生髮展、腫瘤微環境的機理研究,這些複雜的、系統性的研究當然都離不開動物模型的應用。在此就一一細數 IO 研究中用到的小鼠模型。

 

1. 自發、誘導的小鼠腫瘤及其移植瘤模型

正常的小鼠在大約一年半的生命週期裡也有可能罹患癌症,不同品系的小鼠自發腫瘤的機率和類型不同,體現出遺傳因素與癌症易感性的關聯。為了更有效地獲得小鼠腫瘤模型,也可以採用人為的物理(如紫外線、放射線照射)、化學(天然致癌物質和致癌化合物)和生物(病毒等)的方法誘導小鼠產生腫瘤。可以誘導小鼠腫瘤的致癌物有多環芳烴類、亞硝胺類、偶氮染料類、黃曲霉毒素等。實驗室常用的誘導化合物包括MNU(N – 甲基- 亞硝基脲)、DEN(二乙基亞硝胺)、4NQO(4 – 硝基喹啉- 1 – 氧化物)等,可誘導小鼠發生肝癌、食管癌、肺癌、膀胱癌等多種腫瘤,為癌症發生的機理研究提供了有用模型。

研究者也從小鼠的腫瘤建立起很多可在體外培養傳代的腫瘤細胞系,如結腸癌細胞CT26-WT、黑色素瘤細胞B16,肝細胞癌細胞H22,淋巴瘤細胞A20 等,這些腫瘤細胞係不僅為癌細胞的體外生物學研究提供了工具,而且可以移植到遺傳背景相同、不會發生免疫排斥的其它小鼠體內,建立移植瘤小鼠模型。小鼠自發或誘發的腫瘤也可以剖取下來,分割為小組織塊,移植到其它小鼠體內,製作成異體移植瘤模型(allograft)。對於近交系小鼠品系建立的異體腫瘤移植模型,由於小鼠之間的遺傳背景相同,其實相當於自體移植(autograft),又可稱為同基因型(syngeneic)腫瘤移植模型。移植瘤模型由於可以大量製備,荷瘤鼠之間均一性好,因而非常適合抗腫瘤藥物篩选和評價的體內實驗。因為荷瘤鼠體內有著正常的免疫系統,這種模型可以用來研究腫瘤和免疫系統的相互作用,也可以進行一些腫瘤免疫治療的概念性(proof of concept)、機理性(mechanism)研究。

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2. 基因工程小鼠腫瘤模型

自發或誘導腫瘤模型都帶有相當的隨機性、不確定性,產生的腫瘤類型、特徵也經常不能滿足研究的需要。隨著基因工程技術的發展成熟,對小鼠進行遺傳修飾—包括轉入新基因、刪除基因、基因替換等成為可能。

研究發現,在小鼠上過表達某些致癌基因或者敲除某些抑癌基因可以導緻小鼠易發腫瘤。於是利用基因工程手段來研發各類小鼠腫瘤模型的工作越來越多。比如 p53 基因敲除的小鼠,純合體一般在 3、4 個月內發生各類腫瘤,雜合體在 6 個月之後也多發腫瘤。組織特異性地敲除 Pten 基因,則導致這種特定的組織中高發腫瘤。過表達 Ras、Myc 等這些癌基因的轉基因鼠也易發各種腫瘤。人們可以把在臨床研究中發現的與腫瘤相關的基因突變通過基因工程手段,如轉基因、基因編輯等方法復現在小鼠基因組上,驗證這種突變的致癌作用,以及探尋該種基因突變驅動的腫瘤的生物標誌物(Biomarker)、診斷和治療方法等。

基因修飾小鼠模型(genetically engineered mouse model, GEMM)產生的腫瘤也可以移植到相同遺傳背景的其它小鼠體內,建立異體移植瘤模型,這被稱為 GDA( GEM-derived allograft)模型。

這裡有個非常好的例子:

GEM 腫瘤模型的例子即 KPC(LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx-1-Cre)小鼠。 KrasG12D 是人類腫瘤中常見的 Kras 基因的活化突變體,Trp53R172H 則是 p53 基因的突變體。在這兩個基因編碼區和啟動子之間插入 loxp-Stop-loxp 序列,然後將這兩個基因構件轉入小鼠基因組,製作出雙轉基因小鼠。由於「Stop」序列的存在,這兩個基因並不​​會被轉錄。當雙轉基因小鼠再與Pdx-Cre 小鼠配在一起,Pdx 驅動表達元件使Cre 重組酶得以在胰腺組織特異表達,切除一對loxp 之間的「Stop」序列,KrasG12D 和Trp53G12D 基因開始表達,其結果是小鼠在2、3 個月內幾乎都有胰腺腫瘤發生,並有腫瘤轉移現象。 KPC 小鼠為胰腺癌這一癌症之王的研究提供了絕好的研究工具。

 

3. 分子嵌合小鼠腫瘤模型

小鼠模型雖然可以為人類腫瘤的研究提供有用工具,但有時並不理想,因為畢竟人和小鼠在遺傳、生理 / 病理方面存在著巨大差異。對於 IO 研究,腫瘤和免疫系統都可能存在種屬差異,生物標誌物、抗腫瘤藥物靶點、藥物反應性、治療有效性都有不同之處。

通過基因工程的方法,包括經典的轉基因技術、基於胚胎幹細胞基因打靶的基因敲出/ 敲入技術以及新興的基因編輯技術將人源基因導入小鼠基因組,可以建立基因「人源化」小鼠。這種小鼠體內表達某種研究者感興趣的人特有的蛋白,成為在分子水平上的人鼠嵌合體。這種人源化可以遺傳給後代,使其成為有特殊用途的新品系小鼠。基因人源化小鼠在許多領域得到應用,包括腫瘤免疫治療研究。

免疫檢查點(immune checkpoint)是近年來發現的利用自身免疫功能抗腫瘤的重要藥物靶點。針對 PD1/PDL1 這一對 「免疫剎車」信號分子的單抗藥物已被證明具有強大的抗腫瘤效用。由於這些抗體藥物都是針對人的靶點設計和篩選的,它可能只識別、結合人的 PD1、PDL1,就無法用動物做臨床前體內評估實驗。

為了解決這個問題,可以通過基因編輯技術將小鼠的PD1、PDL1 基因替換為人的基因,這樣小鼠的細胞上就表達人的PD1、PDL1,可以用來試驗抗人PD1、PDL1 抗體藥的作用。在做基因編輯的設計時,為了保證這些信號分子與小鼠細胞內信號轉導分子之間的相互作用正常進行,一般只替換蛋白分子的胞外區基因片段,使其表達人的抗原靶位,而保持小鼠源的胞內區。

以人源化PD1 小鼠的應用為例,評價抗PD1 抗體藥的抗腫瘤效果時,先在這種小鼠上接種一個表達PDL-1(這個分子在人鼠之間同源性較高)的同背景腫瘤細胞(如小鼠結腸癌細胞系MC38),然後就可以用荷瘤模型給藥來評估有無抑制腫瘤的效果。如果藥物可以阻斷 PD1/PDL1 之間的結合,解除免疫抑制,免疫系統活化,重新開始攻擊腫瘤,就可以觀察到小鼠腫瘤的生長抑製或消退。

基因人源化小鼠應用於腫瘤免疫治療研究的另一個例子是在雙特異性抗體(bispecific antibodies)的體內篩選、評估試驗中。有一大類抗腫瘤雙特異性抗體藥的設計原理是它既可以結合一種人的腫瘤抗原,又可以結合人的T 淋巴細胞上的CD3 分子,這樣雙特異性抗體可以把T 細胞連接到腫瘤細胞上,同時激活T 細胞,從而來攻擊殺傷腫瘤。由於腫瘤抗原、CD3 分子這兩個靶點都是人的,在普通小鼠模型上無法評價這類雙特異性抗體。一般CD3 上的靶點在其ε亞基上,因此可以將CD3E 基因人源化,然後在其T 細胞上表達人CD3E 的小鼠上接種表達有人的特定腫瘤抗原的小鼠腫瘤細胞,這個體系就可以用來測試評估雙特異性抗體的抗腫瘤效果。

 

4. 人源腫瘤小鼠移植模型

將人的腫瘤移植給小鼠,可以建立人源化腫瘤小鼠模型,前提是小鼠受體必須是免疫缺陷的,否則將被免疫排斥。最早的人源腫瘤模型在裸鼠上建立成功。裸鼠為先天性無胸腺的小鼠品系,體內缺乏 T 淋巴細胞。這說明 T 細胞在異種排斥中起著至關重要的作用。後來發現在免疫缺陷程度更高的小鼠上人源腫瘤更易生長,如 T、B 淋巴細胞聯合缺失的 scid 小鼠、Rag1/Rag2 敲除小鼠等。

目前,最為廣泛使用的作為人源化受體的高度免疫缺陷小鼠品係是NOD prkdcscidIl2rgnull 小鼠,即非肥胖型糖尿病小鼠NOD 遺傳背景,SCID 基因突變,Il2 受體的gamma 鏈亞基敲除的小鼠,由日本的CIEA 研發的被稱為NOG,由美國Jackson Laboratory 研發的被稱為NSG,由北京維通達公司生物技術公司研發的被稱為NPG。此類小鼠之所以被選擇,是因為:

(1)NOD 背景的小鼠存在許多先天性免疫功能的缺陷,如巨噬細胞對人源細胞吞噬能力弱(由於其不同於其它品系小鼠和更接近人的Sirpα分子的結構);補體系統缺失;樹突狀細胞功能弱等。

(2)prkdc 基因在B 細胞抗體基因重排及T 細胞受體基因重排過程中均發揮不可替代作用,這個基因突變導致T 細胞、B 細胞發育阻滯,使機體細胞免疫、體液免疫功能聯合缺失。

(3)Il2rg 基因是多種白介素受體的共同亞基,它缺失後多種免疫功能受損,尤其是 NK 細胞活性完全喪失。這些特點結合在一起,使 NPG 類小鼠成為迄今為止免疫功能缺失最嚴重,最適合接受人源細胞移植的小鼠品系。

人源腫瘤移植模型可以分為CDX(cell line derived xenograft)模型和PDX(patient derived xenograft)模型,前者是由已經建立的各種腫瘤細胞系接種小鼠,後者是由臨床獲得的病人的腫瘤組織直接移植給小鼠建立腫瘤模型。 PDX 模型因為更多的保留著病人腫瘤的「原生態」,包括腫瘤細胞的異質性、腫瘤的微環境,因而更具有臨床相關性。 CDX 模型的特點則是容易獲得,永久傳代,每個細胞係都有較多數據積累,一致性較高,便於多地點比較研究……。

腫瘤模型一般為皮下接種,因皮下瘤便於觀察和測量。也可作腹腔內、腎包膜下以及「原位」接種,如肝癌組織細胞接種於肝,血液瘤注射入血液,乳腺癌接種於乳腺管等。原位接種使腫瘤微環境更接近真實,更易發生轉移現象。 PDX、CDX 腫瘤模型都廣泛應用於腫瘤學研究和抗癌藥物的體內篩選、評估實驗。然而,由於使用免疫缺陷動物建立腫瘤模型,體內沒有正常免疫系統,使得這種模型「先天不足」。免疫細胞是腫瘤微環境中的重要成分,對腫瘤的發生、發展、治療效果都扮演著至關重要的作用。建立既具有人的免疫系統又有人的腫瘤的動物模型是研究者長久以來的一個追求。

 

5. 人源免疫系統 – 腫瘤小鼠模型

人源化動物模型(humanized animal model)指攜帶有人的功能性基因的動物或移植了人的細胞、組織、器官的動物,後者也稱嵌合體動物。即人源化包括基因水平的人源化以及組織細胞水平的人源化。導入人源成分之後,就使某些原來只能在人體上進行的體內實驗可以在動物上進行,解決了人體實驗的倫理詰難。

在IO 研究當中,如前面講到,個別或少數基因的人源化小鼠可以在某些方面獲得應用,但總體而言實驗仍然建立在小鼠的腫瘤和小鼠的免疫系統之上,依然無法反映人體系統的情況和反應。

NPG 這類高度免疫缺陷小鼠的出現,使向小鼠移植人的造血 / 免疫系統成為可能。目前,人源化造血/ 免疫系統小鼠可以歸為三大類:移植成體外周血單個核細胞(PBMC)或分離的免疫細胞的模型;移植來自人的臍帶血、胎肝的造血幹細胞( HSC)的模型;聯合移植來自同一供體的胸腺、胎肝、骨髓造血幹細胞(Bone、Liver、Thymus-BLT)模型。這些模型各有自身的特點,也各自存在一些不盡人意的缺點(見下表)。

 

PBMC 移植 NPG 類小鼠建立的模型,因為含有成熟的免疫細胞,因而可以進行某些要求人的免疫功能的體內實驗。移植之後這些成熟的免疫細胞中的 T 淋巴細胞會受到小鼠異種抗原刺激而增殖,其它種類細胞則維持較低含量,有的細胞壽命有限而從體內消失。所以 PBMC 移植模型的人源細胞以 T 細胞為主。移植的人源免疫細胞,主要是T 細胞,還會對受體小鼠產生免疫攻擊,發生髮生移植物抗宿主反應(GvHD),並在大約數週之後引起小鼠死亡,所以PBMC 模型可供實驗的窗口期較短,只適合於短期性研究。

造血幹細胞是所有造血和免疫細胞的共同祖細胞。 HSC 移植 NPG 類小鼠之後可以定植於小鼠骨髓,並不斷產生各類造血、免疫細胞,如 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、髓系細胞等。由於其免疫細胞是在小鼠體內「從頭」發育出的,對小鼠宿主產生耐受,所以不出現 GvHD 現象,模型存活一年還可以在血中檢測到人源細胞穩定存在。這種模型的缺點是發育出的 T 細胞功能較弱。這是因為 T 細胞需要在胸腺中完成「education」過程,T 細胞受體形成 MHC 限制性。人源T 細胞的前體在小鼠胸腺內完成發育,可能既表現小鼠MHC 限制性,也表現HLA 限制性,造成與人源細胞相互作用類似於異體(allo-)或異種(xeno-)排斥反應。

為了解決T 細胞在人源化小鼠體內不能正常發育的問題,又發明了BLT 模型,就是將胎胸腺和胎肝小組織塊合併移植到小鼠腎包膜下,再移植分離自同一個體的胎肝或骨髓的造血幹細胞。這樣人源前體細胞可以遷移到腎包膜下生長的胸腺類器官中發育出自身 MHC 限制性的功能性 T 細胞。 BLT 模型被認為是人的免疫功能最完善的人源化小鼠模型。但是,由於 BLT 模型的人源組織材料取自流產胎兒,來源非常有限,且面臨很大的倫理爭議,因而應用受到限制。

將 PDX/CDX 腫瘤移植模型跟人源化免疫系統模型結合起來可以用於人類腫瘤免疫方面的研究,如 PBMC 模型加腫瘤模型、HSC 模型加腫瘤模型。這些模型已經在腫瘤與免疫系統的相互作用研究以及腫瘤免疫治療研究當中獲得應用,但是也有一些問題未能解決。

PBMC 移植再加腫瘤的模型,因為模型的穩定期短,腫瘤接種時機需要精確把握。更關鍵的,因為很難獲得相同 HLA 配型的 PBMC 和腫瘤,所以 PBMC 對腫瘤存在異體排斥。排斥作用太強則腫瘤不能在模型上生長。所以需要篩選、匹配合適的 PBMC 和腫瘤供體來建立共移植模型。

HSC 移植加腫瘤的模型出現腫瘤被排斥的情況較少,但也需要對 HSC 供者跟腫瘤做一定篩選匹配。 HSC 移植加腫瘤的模型作為腫瘤免疫模型有幾點必須考慮:

(1)人 T 細胞在小鼠胸腺完成發育,大部分錶現小鼠 MHC 限制性,視人 MHC 為異己;

(2)APC 細胞對 T 細胞的「Prime」作用存疑;

(3)T 細胞對人腫瘤的反應類似一種異體 / 異種排斥反應,反應有可能強有可能弱,不能以 HLA 配型與否預測;

(4)T 細胞對腫瘤的反應可能以 CD8 + 細胞毒反應為主。

雖然因為MHC 匹配問題,HSC 移植模型發育出的T 細胞功能不太正常,但因為其免疫調控機制很多還是存在的,可以被激活和發揮功能,所以這類模型有可能應用於腫瘤免疫微環境研究、immune checkpoint inhibitor 抗癌藥物評價、雙特異性抗體抗癌藥物評價(不依賴MHC 識別)、CAR-T 治療腫瘤的研究(也不依賴MHC 識別)以及作為因子釋放綜合徵(cytokine release syndrome)模型,等等。

不可否認的是現有人源化免疫系統小鼠模型仍然存在諸多缺陷,不能滿足腫瘤免疫研究中的需要。為此正在研發下一代的人源化小鼠,包括MHC 基因人源化小鼠(表達HLA 的小鼠),轉入人源細胞因子如IL-2、IL-3、GM-CSF、SCF 等以能更好支持功能性免疫細胞發育的小鼠。使用自身 MHC 分子敲除的 NPG 類小鼠製作 PBMC 人源化小鼠則可以延緩 GvHD 的發生,拓展了此類模型應用的窗口期。

文章來源:維通達

題圖來源:站酷海洛

生物學霸

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生物學霸

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