硬核 | 細胞培養筆記

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不同的細胞,喜歡的環境是不一樣的

有一些細胞是數量多一點比較好生長,生長狀態也比較好。這種一般是屬於生長速度慢的細胞,譬如內皮細胞。而有一些細胞是數量少一點細胞狀態會生長的比較好,譬如巨噬細胞和某些腫瘤細胞。

巨噬細胞,生長速度非常快,貼壁速度很快,所以傳代時就應該留很少量的細胞,這樣細胞狀態會比較好。並且它比較喜歡扎堆生長,而堆與堆之間是有空間的。如果長得連成一片,細胞形態就會差,老化的會比較多,對後期實驗結果不好。

所以在養細胞的時候應該摸索該細胞喜歡的生長空間密度。

養的細胞形態怎麼都不好?

對於貼壁細胞,如果細胞形態不好或者細胞形態不清晰,表面似有異物等,可以在傳代的時候進行如下操作:

首先,倒掉舊的培養基,加入 3 ml 新的培養基(有無血清的都可)洗滌一次,用滴管吸走。然後再加入 3 ml 的培養基,進行預吹打,控制吹打力度,輕輕地沿著瓶底過一遍,然後吸走。這時侯再開始正式的消化、吹打。巨噬細胞我只吹打,不消化。

其次,把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養瓶內。培養瓶事先加入培養基,放入培養箱內培養,按時間點觀察細胞貼壁情況。 10 、20 、30 分鐘觀察一次。選擇一個時間點,在已經有部分細胞貼壁的情況下,重新置於潔淨台,底面朝上迅速倒出其中的培養基,加入 3 ml 新培養基再輕輕洗一次。然後加入完全培養基培養。後續觀察細胞生長情況以及形態。我稱之為「二傳」。

如果一次效果還不理想,可重複多次。直到找到細胞完美形態。其中要注意,結合細胞喜歡的生長情況。喜歡多一點數量長得好的細胞你就等貼壁細胞比較多點的時候再傳。反之亦然。

培養瓶內加入多少培養基?

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這個是要靠自己針對自己養的細胞去摸索。並不是小的玻璃方瓶 要 12 ml,大方瓶要 14 ml 。有些細胞反而是培養基少一點相反細胞形態會長得比較好。對於生長速度快的細胞,易生長的細胞加少一點培養基,細胞形態會更好。但是要注意換。

如何選擇培養瓶?

生長速度快的細胞在塑料瓶這種相對「更安逸」的環境裡反而長得狀態不如玻璃瓶好。所以對於生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態,塑料瓶比玻璃瓶會好,對於生長速度慢的細胞,玻璃瓶則會更好。

同樣,對於同一種細胞,在其生長速度慢的時候,塑料瓶會好一點,比如剛剛複甦的時候,或者原代培養的時候。而在其生長旺盛的時候,玻璃瓶則相對會好一點。

傳代時怎麼消化?

可以這樣說,對於需要消化傳代的細胞,每一次的消化都是對這個細胞存活與否,狀態好與不好最至關重要的考驗。

在消化的過程中,你加入胰酶後,所有細胞都在被胰酶消化著,但是我們忽視了一個問題。細胞的生長狀態是不一樣的,每一個細胞的貼壁情況也是不一樣的。我後來對消化的方法進行了改良,我稱之為「四步消化法」。以難消化細胞為例,具體操作如下:

首先不加胰酶,倒掉舊培養基加入少量新培養基洗 1-2 遍,目的是將漂浮著的死細胞之類盡量洗掉。

然後再加入少量新培養基直接吹打一遍,這一遍是把貼壁不牢固的細胞吹打下來。再用培養基洗一遍,兩次所得懸液混合傳入新瓶。你可以將這些傳入新瓶培養,以與後面胰酶消化過的細胞對比觀察看誰長的更好一點就知道該細胞對胰酶的敏感度。

吸乾淨瓶內剩餘液體,加入 0.3 ml 左右的胰酶潤洗一遍,吸掉棄之,再加入 1 ml 左右的胰酶消化。消化的同時置於顯微鏡下觀察,待細胞與細胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶與乾淨子彈頭里備用,加入新培養基開始吹打,吹打2-3 遍後吸取懸液於試管或新瓶暫存。用 2 ml 左右新培養基洗一遍與前面的混合。你也可以傳入新瓶培養,以與後面及前面的做對比。

然後把前面剛吸出來的胰酶重新加進瓶裡,繼續消化剩餘的貼壁牢固的細胞。當然你也可以用新的胰酶。繼續鏡下觀察,待剩餘細胞間隙明顯,細胞獨立開來的時候,吸掉胰酶,加入新培養基吹打。懸液傳入新瓶培養,根據你實際情況自己把握。

其實還可以有第五步,對於特別難消化的細胞和對胰酶特別敏感的細胞的話,你可以繼續加第五步甚至第六步。為了細胞更好的狀態,更漂亮的樣子,沒辦法,你必須分多批多次消化,這樣才能最大限度地將胰酶對細胞的損傷降到最低,保證細胞的狀態能夠最優。

當然了,如果細胞是屬於那種很容易消化的細胞,像 RAW264.7,僅僅第二步就搞定。就沒必要第三步第四步了。這個需要你在實驗中自己用心去體會。建議你接受一個新細胞時把各步消化的細胞分別培養起來做比較,去摸索好細胞對胰酶的要求。便於你後續實驗的開展。

將細胞消化分成這幾步,除了是為了避免胰酶對細胞的損傷之外,還有一個更重要的作用就是,可以最大程度地把細胞吹打成單個單個的狀態,不成片不連體。

因為細胞生長的時候肯定是要相互聯繫,大部分的細胞都是要成片生長的,尤其是對於貼壁細胞,單個細胞貼壁之後長著長著就長到一片去了。但是如果是成片的細胞抱團的話,傳代後細胞是不能貼壁的,這樣抱團的細胞就會死亡。所以,消化傳代的時候一定要將細胞消化成單個的獨立狀態,這個非常考究你的功夫。

細胞一旦脫落入懸液裡,你很難再將他吹打成單個。所以必須要在細胞未脫落之前將其吹打開,受力點就是細胞貼壁的地方。既要消化到容易吹打下來,又不能太過,一吹就整片脫落,要單個單個地往下掉。所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長狀態貼壁程度的細胞能夠都維持在好的受力點分散開。這個是很重要的一點。

另外關於傳代很重要一點就是,一定不能等到細胞長滿的時候才去消化傳代。要在細胞長到 70% 左右的時候就要傳代了,一旦發現細胞生長中已經有疊層生長的時候就要立即進行消化傳代。不能再拖了。

換液傳代時如何洗瓶

對於用 DMEM 培養基培養的細胞,你在洗的時候如果是用無血清 1640 去洗細胞在隨即後的幾次中會比用 DMEM 洗的長的要好。同樣,用 1640 培養的也有這個現象。

如果不嫌麻煩的話,可以用 PBS 來洗,洗的效果和用無血清培養基洗的效果基本上是一樣的,對於有些細胞會更勝一籌。洗的目的主要是洗去培養瓶裡殘留的血清,防止它對胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優先,是很關鍵的一點。

傳代時 PBS 洗是很重要的一步

用 PBS 就可以把細胞消化開來。加入 PBS 放置 10-15 分鐘,有些需要更長的時間,等到細胞一個個分離開來的時候,就可以直接吹打下來。但是和胰酶消化一樣,要控制好時間,不能時間太過了。要不然損傷細胞,細胞不容易成活,狀態容易不好。

這個方法對於某些細胞是很管用的。有些細胞用胰酶消化不容易消化成單個的時候,或者臨時沒有胰酶了,可以選用此方法。不過一定要試試,看是否適合你的細胞。

生物學霸

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生物學霸

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