獻給初學者:如何選擇合適的熒光蛋白

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自 1992 年綠色熒光蛋白被用於標記基因,各種顏色的熒光蛋白被開發出,目前有上百種的熒光蛋白。

在我們的實驗中,經常會用到熒光蛋白,但是如何選擇合適熒光蛋白,得到完美的實驗結果?相信這個問題一直困擾著大家,鑑於此,小編從不同的角度去考慮如何選擇熒光蛋白,希望可以給大家在選擇熒光蛋白方面提供一些幫助。

Tubes of various fluorescent proteins displayed in a box with UV light shining on them.

單體性質

將熒光蛋白與目標蛋白進行融合表達,直接地追踪目標蛋白或是定位目標蛋白,這就要求熒光蛋白是單體,不能影響目標蛋白的功能和定位。因此,我們將熒光蛋白的單體性質放在第一位。

目前體外檢測熒光蛋白單體性質的方法有分子篩、沉降平衡,可以通過熒光蛋白分子篩的峰圖是否狹窄,單一粗略的判斷其是否為單體,沉降平衡能夠更加準確的確認其聚合性質。我們使用熒光蛋白幾乎都是在細胞內或組織內,因此我們更加關心在生理條件下,熒光蛋白的聚合性質。

科學家巧妙地將熒光蛋白與細胞色素P450 進行融合表達,讓熒光蛋白定位在內質網的胞質面,熒光蛋白的聚合性質會使鄰近的熒光蛋白聚合在一起,形成聚集體,在激光共聚焦顯微鏡下能夠看到細胞核的周圍有很大的點狀結構。小編已經用此種方法檢測了多個熒光蛋白。

The structure of mEos2

小編發現綠色熒光蛋白中,單體性質比較好的是 mEmerald,該蛋白很少形成大的點狀結構,並且目前還沒有稱該蛋白會影響定位的報導。

此外 mEmerald 是一個非常穩定的綠色熒光蛋白,因此可以用於線性的結構光照明超分辨熒光顯微成像。

我們還發現紅色熒光蛋白中沒有一個單體性質特別好,相比較來說,mApple 的單體性質最好,但是在使用該蛋白的過程中,發現mAppple 會影響某些蛋白的定位,因此在使用紅色熒光蛋白時,要謹記紅色熒光蛋白可能會影響目標蛋白的定位。

PK 值

每個熒光蛋白都有其最合適的 pH 值,即在一定的 pH 值下,熒光強度最高。有的熒光蛋白適合在酸性環境下使用,相反有的適合在鹼性環境下使用,因此在選擇熒光蛋白時需要考慮熒光蛋白的 PK 值。

Change in relative fluorescence intensity (RFU) with pH for eGFP(grey triangles) and bfloGFPa1 (black squares)

在細胞內,大多數細胞器內及細胞質的 pH 值都在 7.0 左右,然而溶酶體內的 pH 值就比較低,因此常規的熒光蛋白並不適合用於標記溶酶體內的蛋白。

mCherry 的PK 值比較低,適合在酸性的環境下使用,可以用於標記溶酶體內的蛋白,但是該熒光蛋白有一定的二聚性質,可能會影響目標蛋白的定位,在使用該熒光蛋白時要綜合考慮單體性質和PK 值。

在選擇熒光蛋白時,要考慮目標蛋白定位環境的 pH 值,再考慮使用相應 PK 值的熒光蛋白。同時也可以考慮利用熒光蛋白的 PK 值的特性,幫助我們解決問題。

成熟時間

熒光蛋白在發光之前需要經歷轉錄、翻譯、折疊等步驟,其中折疊過程佔據了大部分時間,我們將此過程稱之為成熟時間。在標記短壽命的目標蛋白時,如果熒光蛋白的成熟時間太長,可能會出現在目標蛋白開始降解時,熒光蛋白還沒有發光,導致無法追踪及定位目標蛋白。因此在選擇熒光蛋白時,需要考慮其成熟時間。

小編在實驗時發現,mEmerald、Dendra2 的成熟時間比較快,在用 Lipo2000 轉染試劑盒轉染 U2OS 細胞時,轉染後四個小時就能夠用熒光顯微鏡觀察到了熒光信號,EGFP 沒有信號。但是在用 P450 方法檢測時,Dendra2 會形成很大的聚集,表明該熒光蛋白的單體性質不好,有可能影響目標蛋白的定位和功能,在使用該蛋白的過程中應該注意這個特性。

為了能夠更早地觀察某些短壽命熒光蛋白的生理特性和定位情況,科學家正在發展成熟時間更快的熒光蛋白,並且用於超分辨成像。

光穩定性

熒光蛋白在發光的同時會被漂白,逐漸失去發光能力,因此要想獲得更多的信息,就需要熒光的光穩定性好。在普通的熒光成像中,對熒光蛋白的光穩定性要求並不是很高,比如激光共聚焦顯微鏡成像時,熒光信號的穩定性只需要能保證採集的完整的一張圖即可。

在超分辨熒光成像中,對熒光蛋白的光穩定性要求比較高。線性結構光照明顯微鏡要求熒光蛋白始終處於亮的狀態,需要通過結構光采集多幅圖進行重構;非線性結構光顯微鏡則要求熒光蛋白在黑亮之間進行多次切換,這就要求熒光蛋白能進行反复的光調控,並且依舊維持著高的亮度;與非線性結構光顯微鏡一樣,可逆飽和光線性熒光轉移顯微鏡也要求熒光蛋白能夠在黑亮之間進行反复的光調控。

優化密碼子

大多數熒光蛋白是來自於海洋生物,因此密碼子偏好性與所要標記蛋白的物種有較大的差異,這種密碼子偏好性差異可能會導致熒光蛋白在哺乳動物細胞或組織中的表達量極低,以至於看不到熒光信號。

幸運的是大多數熒光蛋白的密碼子已經經過優化,適合在哺乳動物細胞中進行融合表達。但是當需要使用熒光蛋白在其他種屬細胞內表達時,應考慮一下密碼子偏好性。

小編在進行線蟲熒光成像時,就遇到過此類問題,沒有優化密碼子時,熒光蛋白的表達量比較弱,在熒光蛋白經過密碼密碼子優化,並且在DNA 序列之間插入線蟲的內含子後,熒光蛋白的表達量得到了較大的提高。

在比較少見的物種進行熒光成像時,需要把密碼子優化這個特性考慮在內。

N 端或 C 端

在選擇了相應的熒光蛋白後,我們需要確定把目標蛋白放在熒光蛋白的 N 端或是 C 端。 N 端與 C 端的區別在於目的蛋白,有的目的蛋白對這個要求不高,但某些目的蛋白就要求在特定的位置進行融合表達。

熒光蛋白與目的蛋白融合表達可能會影響目的蛋白的折疊,這取決於目的蛋白折疊過程中,熒光蛋白所在的那一端有沒有參與蛋白質的折疊。

例如,如果目的蛋白的C 端會被折疊入目的蛋白的內側,那麼我們把熒光蛋白標記在目的蛋白的C 端,將獲得不到熒光信號;有些目的蛋白在後翻譯的過程會切掉一段,如果熒光蛋白處於被切的一端,那麼就不能獲得準確的目的蛋白的定位信息。

如果標記的目的蛋白是一個新的蛋白,我們建議分別進行 N 端和 C 端融合表達,以此來確定哪一個是最好的選擇。除此之外,還可以用免疫熒光來確認目的蛋白定位是否與熒光蛋白融合表達的一致。

綜合以上的介紹,在我們選擇熒光蛋白時,首要考慮的是熒光蛋白的聚合性質,即是否會影響目的蛋白的功能及定位,其次是熒光蛋白的PK 值是否與目的蛋白所處的環境的pH值相匹配,然後是熒光蛋白的成熟時間以及目的蛋白的壽命,綜合兩者決定熒光蛋白是否合適,最後考慮熒光蛋白的光穩定性、密碼子偏好性是否合適,最後考慮目的蛋白放的位置,熒光蛋白是否會影響目的蛋白的功能及定位。

此外,在進行熒光成像時,需要考慮顯微鏡所選的濾光片是否與相應的熒光蛋白質配套,顯微鏡的各種參數是否合適。值得提醒的是,激發光的強度不能太高,否則會導致熒光信號的漂白。

最後,給大家安利一個網站,希望能讓大家的實驗得到幫助,裡面有很多熒光蛋白的性質信息:http://nic.ucsf.edu/FPvisualization/。

 

參考文獻:

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7. Kilaru S, et al. (2015) A codon-optimized green fluorescent protein for live cell imaging in Zymoseptoria tritici. Fungal Genet Biol 79:125-131.

生物學霸

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生物學霸

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