我問師兄怎麼純化包涵體,他說……

在做蛋白表達與純化的路上,總是充滿著各種各樣的挑戰,要麼蛋白無法表達,要麼表達的蛋白檢測不到……尤其是當純化的蛋白在包涵體中,不溶,不掛柱,這可怎麼辦呢?所以,如果前期花點時間優化實驗設計,將會大大節約後續純化的時間,省去不必要的麻煩。比如,要純化包涵體,首先需要了解…

什麼是包涵體?

通常所說的包涵體(Inclusion Bodies, IB),是指細菌(或原核生物細胞)中表達的非結晶、無定形結構的蛋白質聚集體1。在大腸桿菌中表達重組蛋白時,大約有70% 的重組蛋白以包涵體的形式存在2。包涵體無生物活性,難溶於水,但可溶於變性溶劑如尿素、鹽酸胍等1。將包涵體溶解後,即可離心並純化相應的上清。

目前,除離子交換法、疏水法之外,親和層析法是一種被廣泛使用的包涵體純化方法。將蛋白加上標籤後,其可以與連接有配體的層析介質特異性結合,以此分離純化。在眾多的純化標籤中,有兩個標籤可以用來在變性條件下純化蛋白——His-tag 和 Strep-tag 。這兩種標籤都屬於重組蛋白表達中常用的標籤,至於兩者之間的對比,在這裡給大家列出一張表格以供參考:

(圖片來源:哺乳動物細胞表達的難點和解決方案,都幫你整理好了)

為了比較兩種標籤的實際純化效果,這裡做了兩個小測試。分別在天然條件和變性條件下,將mCherry, GAPDH 或目的蛋白,與標籤His6-tag 和Twin-Strep-tag® 重組,表達後,在兩種標籤各自的純化條件下進行純化,跑膠觀察結果。

在配體的選擇上, His6-tag 重組蛋白使用 Ni-NTA 純化, 而 Twin-Strep-tag® 重組蛋白則使用填料Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XT(IBA Lifesciences,德國)進行純化。

(圖片來源:iba)

最新展覽訊息

九月, 2019

079月08:30:s16:30:s軟骨修復趨勢論壇08:30:s - 16:30:s 台大國際會議中心

189月全日22第22屆全國臨床腫瘤學大會暨2019年CSCO學術年會創新精準研究 探索智慧醫療(全日) 廈門國際會議中心

189月(9月 18)13:30:s20(9月 20)17:00:s2019年國際醫療照護品質與安全論壇IFQSHTransforming Quality for Tomorrow13:30:s - 17:00:s (20) 臺北萬豪酒店

顯示更多

Twin-Strep-tag® 標籤搭配 Strep-Tactin®XT 組合而成的第三代 Strep-tag® 高效蛋白純化系統(如下圖),有接近共價的高親和力。

(圖片來源:iba)

Protocol

克隆與表達

1. 將編碼mCherry,GAPDH 和目的蛋白克隆至表達載體中(IBA Lifesciences),構建Twin-Strep-tag® 和His6-tag 重組蛋白表達載體,後將載體分別轉化至大腸桿菌BL21 中,表達並收集菌體(IBA Lifesciences Protocol PR86-0001)。在含氨芐青黴素的 LB 或 HD 培養基中培養菌體,並以合適的光密度誘導。
2. 收集菌體並重懸於緩衝液中。 His-tag 重組蛋白使用Ni-NTA Lysis Buffer(50 mM NaH2PO4,pH 8.0,300 mM NaCl 10 mM 咪唑); Twin-Strep-tag 重組蛋白使用Buffer W(100 mM Tris / HCl,pH 8.0,150 mM NaCl ; 使用1 mM EDTA)。
3. 超聲破碎,並離心。

純化

「天然條件:mCherry,GAPDH」

1. 使用 Ni-NTA Lysis Buffer 和 Buffer W 分別平衡 1 mL Ni-NTA,Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XTSuperflow® 純化柱,後將得到的蛋白上清液取 3 mL 加入柱中。
2. 使用2 CV(Column Volume, 柱體積)的Ni-NTA Wash Buffer(50 mM NaH2PO4,pH 8.0,300 mM NaCl 20 mM 咪唑)清洗Ni-NTA 柱4 次,1 CV 的Buffer W 將兩個Strep -Tactin® 柱清洗8 次。
3. 使用 0.5 CV 的洗脫液洗 6 次。

洗脫液:Ni-NTA:50 mM NaH2PO4 pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM 咪唑
Strep-Tactin®:Buffer E(Buffer W + 2.5 mM 脫硫生物素)
Strep-Tactin®XT:Buffer BXT(Buffer W + 50 mM 生物素)

變性條件:目的蛋白

1. 室溫條件下,細胞沉澱在緩衝液中持續攪拌溶解 15~60 分鐘,後離心。
緩衝液:Buffer W:(含有 8M 尿素,Twin-Strep-tag®)
Buffer B:(100 mM NaH2PO4 pH8.0 10 mM Tris / HCl 8M 尿素; His-tag)
2. 上柱前,使用 Buffer W 將溶解的蛋白稀釋至尿素濃度為 4M 和 6M, 用於 Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XT 純化。
3. 使用含有適當濃度尿素的 Wash Buffer 平衡純化柱 1 mL Ni-NTA,Strep-Tactin®,和 Strep-Tactin®XT。取含之前有蛋白的上清,加入柱中。
4. 使用 1 CV 含有尿素的 Buffer W 或 Buffer C 清洗純化柱,反復清洗直到 A 280 nm 低於 0.1 或者達到恆定為止。
5. 使用 0.5 CV 的洗脫液洗 6 次。
洗脫液:Ni-NTA:Buffer D1 :100 mM NaH2PO4, pH 5.9, 10 mM Tris / HCl 8M 尿素:Buffer D2(pH 4.5 的 Buffer D1)用於洗脫第二步。
Strep-Tactin®:Buffer E + 尿素
Strep-Tactin®XT:Buffer BXT + 尿素

最後通過 SDS-PAGE 分析所有洗脫組分,並用 Nanodrop 測蛋白濃度。

结果

對比 SDS-PAGE 分析,可發現 Strep-tag® 系統使用流程簡便,在天然還是變性條件下純化的蛋白,純度皆高於 His-tag 系統。

– 比較第三代 Strep-tag® 系統 (左)與 His-tag 系統(右)在 native 條件下,純化 mCherry 及 GAPDH 蛋白的表現

無論是 mCherry 或是 GAPDH,使用 Strep-tactin®XT : Twin-Strep-tag® 都能得到純度較高的目標蛋白(見 Elution)。

Western blot 分析結果顯示,提取 mCherry 所出現的雜質為其降解產物。

(圖片來源:iba)

比較 His-tag 系統(左)與第二、三代 Strep-tag® 系統(中、右)在變性條件下,純化不同蛋白的效果

使用第三代 Strep-tactin®XT 能在使用 6M 尿素的變性條件中,獲得大量高純度的蛋白;相對而言,使用 Strep-tactin® 僅能得到極少量蛋白。

而使用 Ni-NTA 雖然能在將 pH 值調降至 4.5(E2)情況下,純化蛋白,但得到的最終產物仍含有許多雜質。

(圖片來源:iba)

因此,綜合下來我們可以發現,Strep-Tactin®XT:Twin-Strep-tag® 在天然條件下和變性條件下純化的蛋白都有很高的純度。

操作上,His-tag 系統在洗脫時需要不同 pH 的 2 種 Buffer 來達成。而 Strep-Tactin®XT 的操作步驟則較為簡單,且 Buffer 中不含咪唑,不會干擾 260/280 nm 的測定,也省去後續除咪唑和脫鹽等步驟。更多資料表明,Strep-Tactin®XT 不僅能在溫和的純化流程中產出高純度(純度>95%)、高產量的目標蛋白,且能保持目標蛋白的活性。此純化系統在有表面活性劑的環境中也有良好的純化表現,柱子可以多洗幾次,不會造成目標蛋白流失。即便是量少的蛋白或是膜蛋白,也有良好的純化效率。

(圖片來源:iba)

同時Strep-Tactin®XT 還可用於變性條件下的純化,或WB/ELISA,偵測目標蛋白,還可用來固定目標蛋白,檢測蛋白質交互作用,或是更進一步用以篩選治療用蛋白,工業用酵素等等,具有廣泛的應用領域。

(圖片來源:iba)
参考文献:
1. Palmer I, Wingfield PT, 2004: Curr Protoc Protein Sci. 38:6.3:6.3.1–6.3.18. Preparation and Extraction of Insoluble (Inclusion-Body) Proteins from Escherichia coli.
2.  Yang Z, Zhang L, Zhang Y, Zhang T, Feng Y, Lu X, et al. (2011) Highly Efficient Production of Soluble Proteins from Insoluble Inclusion Bodies by a Two-Step-Denaturing and Refolding Method. PLoS ONE 6(7): e22981. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0022981
文章来源:iba
题图来源:站酷海洛
生物學霸

作者

生物學霸

生物學霸是中國丁香園旗下專為科研人員打造的公眾號,在這裡可以免費下載文獻、查找實驗 protocol 和優質產品、獲取實用科研乾貨、覽讀科研趣事與心得。丁香園是中國領先的醫療領域連接者以及數字化領域專業服務提供商。成立19年以來,丁香園打造了國內領先的醫療學術論壇及一系列移動產品,並全資籌建了實體診所。通過專業權威的內容分享平台、豐富全面的數據積累、標準化高質量的醫療服務,丁香園連接醫院、醫生、科研人士、患者、生物醫藥企業和保險,覆蓋千萬大眾用戶,並擁有550 萬專業用戶,其中包含200 萬醫生用戶。

Up Next

相關的 文章

X