在做蛋白表達與純化的路上，總是充滿著各種各樣的挑戰，要麼蛋白無法表達，要麼表達的蛋白檢測不到……尤其是當純化的蛋白在包涵體中，不溶，不掛柱，這可怎麼辦呢？所以，如果前期花點時間優化實驗設計，將會大大節約後續純化的時間，省去不必要的麻煩。比如，要純化包涵體，首先需要了解…

什麼是包涵體？

通常所說的包涵體（Inclusion Bodies, IB），是指細菌（或原核生物細胞）中表達的非結晶、無定形結構的蛋白質聚集體¹。在大腸桿菌中表達重組蛋白時，大約有70% 的重組蛋白以包涵體的形式存在²。包涵體無生物活性，難溶於水，但可溶於變性溶劑如尿素、鹽酸胍等¹。將包涵體溶解後，即可離心並純化相應的上清。

目前，除離子交換法、疏水法之外，親和層析法是一種被廣泛使用的包涵體純化方法。將蛋白加上標籤後，其可以與連接有配體的層析介質特異性結合，以此分離純化。在眾多的純化標籤中，有兩個標籤可以用來在變性條件下純化蛋白——His-tag 和 Strep-tag 。這兩種標籤都屬於重組蛋白表達中常用的標籤，至於兩者之間的對比，在這裡給大家列出一張表格以供參考：

（圖片來源：哺乳動物細胞表達的難點和解決方案，都幫你整理好了）

為了比較兩種標籤的實際純化效果，這裡做了兩個小測試。分別在天然條件和變性條件下，將mCherry， GAPDH 或目的蛋白，與標籤His6-tag 和Twin-Strep-tag® 重組，表達後，在兩種標籤各自的純化條件下進行純化，跑膠觀察結果。

在配體的選擇上， His6-tag 重組蛋白使用 Ni-NTA 純化， 而 Twin-Strep-tag® 重組蛋白則使用填料Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XT（IBA Lifesciences，德國）進行純化。

（圖片來源：iba）

Twin-Strep-tag® 標籤搭配 Strep-Tactin®XT 組合而成的第三代 Strep-tag® 高效蛋白純化系統（如下圖），有接近共價的高親和力。

（圖片來源：iba）

Protocol

克隆與表達

1. 將編碼mCherry，GAPDH 和目的蛋白克隆至表達載體中（IBA Lifesciences），構建Twin-Strep-tag® 和His6-tag 重組蛋白表達載體，後將載體分別轉化至大腸桿菌BL21 中，表達並收集菌體（IBA Lifesciences Protocol PR86-0001）。在含氨芐青黴素的 LB 或 HD 培養基中培養菌體，並以合適的光密度誘導。
2. 收集菌體並重懸於緩衝液中。 His-tag 重組蛋白使用Ni-NTA Lysis Buffer（50 mM NaH2PO4，pH 8.0,300 mM NaCl 10 mM 咪唑）; Twin-Strep-tag 重組蛋白使用Buffer W（100 mM Tris / HCl，pH 8.0,150 mM NaCl ; 使用1 mM EDTA）。
3. 超聲破碎，並離心。

純化

「天然條件：mCherry，GAPDH」

1. 使用 Ni-NTA Lysis Buffer 和 Buffer W 分別平衡 1 mL Ni-NTA，Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XTSuperflow® 純化柱，後將得到的蛋白上清液取 3 mL 加入柱中。
2. 使用2 CV（Column Volume, 柱體積）的Ni-NTA Wash Buffer（50 mM NaH2PO4，pH 8.0,300 mM NaCl 20 mM 咪唑）清洗Ni-NTA 柱4 次，1 CV 的Buffer W 將兩個Strep -Tactin® 柱清洗8 次。
3. 使用 0.5 CV 的洗脫液洗 6 次。

洗脫液：Ni-NTA：50 mM NaH2PO4 pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM 咪唑
Strep-Tactin®：Buffer E（Buffer W + 2.5 mM 脫硫生物素）
Strep-Tactin®XT：Buffer BXT（Buffer W + 50 mM 生物素）

變性條件：目的蛋白

1. 室溫條件下，細胞沉澱在緩衝液中持續攪拌溶解 15~60 分鐘，後離心。
緩衝液：Buffer W：（含有 8M 尿素，Twin-Strep-tag®）
Buffer B：（100 mM NaH2PO4 pH8.0 10 mM Tris / HCl 8M 尿素; His-tag）
2. 上柱前，使用 Buffer W 將溶解的蛋白稀釋至尿素濃度為 4M 和 6M, 用於 Strep-Tactin® 和 Strep-Tactin®XT 純化。
3. 使用含有適當濃度尿素的 Wash Buffer 平衡純化柱 1 mL Ni-NTA，Strep-Tactin®，和 Strep-Tactin®XT。取含之前有蛋白的上清，加入柱中。
4. 使用 1 CV 含有尿素的 Buffer W 或 Buffer C 清洗純化柱，反復清洗直到 A 280 nm 低於 0.1 或者達到恆定為止。
5. 使用 0.5 CV 的洗脫液洗 6 次。
洗脫液：Ni-NTA：Buffer D1 ：100 mM NaH2PO4， pH 5.9， 10 mM Tris / HCl 8M 尿素：Buffer D2（pH 4.5 的 Buffer D1）用於洗脫第二步。
Strep-Tactin®：Buffer E + 尿素
Strep-Tactin®XT：Buffer BXT + 尿素

最後通過 SDS-PAGE 分析所有洗脫組分，並用 Nanodrop 測蛋白濃度。

结果

對比 SDS-PAGE 分析，可發現 Strep-tag® 系統使用流程簡便，在天然還是變性條件下純化的蛋白，純度皆高於 His-tag 系統。

– 比較第三代 Strep-tag® 系統 （左）與 His-tag 系統（右）在 native 條件下，純化 mCherry 及 GAPDH 蛋白的表現

無論是 mCherry 或是 GAPDH，使用 Strep-tactin®XT : Twin-Strep-tag® 都能得到純度較高的目標蛋白（見 Elution）。

Western blot 分析結果顯示，提取 mCherry 所出現的雜質為其降解產物。

（圖片來源：iba）

比較 His-tag 系統（左）與第二、三代 Strep-tag® 系統（中、右）在變性條件下，純化不同蛋白的效果

使用第三代 Strep-tactin®XT 能在使用 6M 尿素的變性條件中，獲得大量高純度的蛋白；相對而言，使用 Strep-tactin® 僅能得到極少量蛋白。

而使用 Ni-NTA 雖然能在將 pH 值調降至 4.5（E2）情況下，純化蛋白，但得到的最終產物仍含有許多雜質。

（圖片來源：iba）

因此，綜合下來我們可以發現，Strep-Tactin®XT：Twin-Strep-tag® 在天然條件下和變性條件下純化的蛋白都有很高的純度。

操作上，His-tag 系統在洗脫時需要不同 pH 的 2 種 Buffer 來達成。而 Strep-Tactin®XT 的操作步驟則較為簡單，且 Buffer 中不含咪唑，不會干擾 260/280 nm 的測定，也省去後續除咪唑和脫鹽等步驟。更多資料表明，Strep-Tactin®XT 不僅能在溫和的純化流程中產出高純度（純度>95%）、高產量的目標蛋白，且能保持目標蛋白的活性。此純化系統在有表面活性劑的環境中也有良好的純化表現，柱子可以多洗幾次，不會造成目標蛋白流失。即便是量少的蛋白或是膜蛋白，也有良好的純化效率。

（圖片來源：iba）

同時Strep-Tactin®XT 還可用於變性條件下的純化，或WB/ELISA，偵測目標蛋白，還可用來固定目標蛋白，檢測蛋白質交互作用，或是更進一步用以篩選治療用蛋白，工業用酵素等等，具有廣泛的應用領域。