基因檢測:對食物中微生物進行戶口調查

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美國疾病管制與預防中心 (CDC) 的資料顯示,食源性疾病造成美國每年約 4,800 萬人生病,128,000 人住院,甚至有 3,000 人因此死亡 [註 1]。在台灣,2001–2010 年平均每年有 285 起食源性疾病爆發,明顯較 1991–2000 年間每年平均 143 起為多,可見其嚴重程度隨著社會與經濟進步其實有增無減,大大威脅著民眾的飲食健康 [註 2]。

foodmicroorganism

食源性疾病可由食物中所含的微生物或其毒素引發。在美國,諾羅病毒 (norovirus) 是引起最多疾病的病原體,而細菌則是導致住院或死亡之主因 [註 3]。食物中的病原體之傳統篩檢方法以「分離培養」和「生物化學檢測」為主,但因為敏感度低且需大量的時間和人力,目前已跟不上日益嚴重的食品衛生查驗需求。取而代之的是近年突飛猛進的核酸分析方法,其敏感性高、時間短、自動化程度較高的特性,已使核酸分析成為現在偵測病原體的主要工具。

核酸分析法的演進

核酸分析法可直接偵測病原體的 DNA 或 RNA 序列,最早的做法是針對病原體的獨特基因序列設計引子 (primer),再針對食物樣本進行 PCR,看看能不能結合並放大目標基因以證明有該病原體的存在,最後再用膠體電泳檢視 PCR 的結果。不過這種方法的敏感度不高,也相當費時費力,因此研究人員努力設法改良。後續也成功開發可同時複製數個基因的多重 PCR (multiple PCR),可提高敏感性並一次偵測多種病原體;或是能夠直接在 PCR 反應槽偵測成果,不須另外進行膠體電泳的即時定量 PCR (real-time quantitative PCR) ;還有可偵測 RNA 基因體之核酸序列擴增法 (nucleic acid sequence based amplification, NASBA) [註 4]。

NASBA 乃以反轉錄酵素製造 RNA 的互補 DNA,再以互補 DNA 為模板複製出 RNA,並且透過不斷循環來大量擴增病原體 RNA。此法最主要的優點是可在固定溫度下運作 (通常為 41°C) 而降低器材複雜度,且後續發展出的即時 NASBA 也讓使用者能夠第一時間得到檢測成果。即時 NASBA 甚至還可判斷食物中是否含有存活的病原體細胞 [註 5],更擴大了其應用範圍。

在 2000 年,Notomi 等人提出同樣在單一溫度下即可大量複製 DNA 的圈環形核酸增幅法 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP) [註 6]。LAMP 所用的 DNA 聚合酶能一邊解開雙股 DNA 一邊進行複製,再加上特殊設計的兩對 (或三對) 引子具有相近之黏合溫度,使其能在單一溫度即發生連鎖反應,快速放大目標 DNA。此法通常只須 35-60 分鐘即可得到結果,且因不需複雜的溫度控制儀器,加上可用 magnesium pyrophosphate 產生沉澱 [註 7] 或 SYBR Green I 螢光顯色 [註 8] 等肉眼可見的方法進行判讀,故很適合用於田間篩檢、小規模實驗室、缺乏物資的偏遠地區、或大規模檢疫工作等,極富應用價值。

未來食物檢驗的趨勢

隨著食物品項和新發現之致病微生物的增加,檢驗方法之精準度、速度與自動化皆須進一步提升。可同時快速偵測數百個目標基因片段的寡核甘酸 DNA 微陣列已廣泛用於篩檢食物中的病原體,但因為製程特殊且價格昂貴,對於規模較小的機構較不符成本效益。不過全基因體定序發展至今,人類基因體定序的費用已降至 1,000 美元左右;而細菌基因體長度只有人類的千分之一,許多商業平台提供的單一菌種定序服務現在不到 50 美元,且 5 天內可完成。全基因體還有另一項優勢,就是可針對致病病原體進行亞型分析 (subtyping),能更有效鑑別食物中的菌株是否就是造成疫情的病原體。

以 2014 年在美國發生的凝乳起司事件為例,美國佛州的 Oasis Brands 在 2014 年 8 月主動回收其凝乳起司產品,因為懷疑受到李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 的污染。兩個月後,美國食品藥物管理局 (FDA) 主動查驗 Oasis Brands 的起士廠房,並從採集的樣品中找到李斯特菌,於是要求該公司回收可能受到污染的產品並關閉廠房。

在完成病原體的全基因體定序後,FDA 進一步發現回收的凝乳起司之李斯特菌基因體與近期從五位感染李斯特菌的患者所分離出的菌株相似。儘管這五位患者發病的時間和地點皆不相同,但後來得知他們都是拉丁裔美國人,且在近期有吃過凝乳起司,只是忘記吃的是什麼品牌。

FDA 隨即利用基因體定序資訊要求餐廳及零售商停止販賣相關產品,同時建議消費者避免食用相關的起司與乳製品 [註 9],不僅在問題擴大前成功防堵,亦有助於受害者求償。上述案例顯示全基因體定序在分析食物病原體確實擁有相當大的優勢。未來這些先進核酸分析技術將會搭配次世代定序與總體基因體學資料庫,不但可用以檢測食物中常見的病原體,也能夠找出更多未知但可能致病的微生物,確實為大眾的飲食安全把關。

參考文獻:
1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). CDC Estimates of Foodborne Illness in the United States. 2011. Available online at: http://www.cdc.gov/foodborneburden/PDFs/FACTSHEET_A_FINDINGS_updated4-13.pdf
2. Chen WJ et al. J Food Drug Anal 2013; 21:261-7
3. Scallan E et al. Emerg Infect Dis 2011; 17:7-15.
4. Compton J. Nature 1991; 350:91-2.
5. Simpkins SA et al. Lett Appl Microbiol 2000; 30:75-9.
6. Notomi T et al. J Microbiol 2015; 53:1-5.
7. Mori Y et al. Biochem Biophys Res Commun 2001; 289:150-4.
8. Njiru ZK et al. PLoS Negl Trop Dis 2008; 2:e147.
9. http://www.cdc.gov/listeria/outbreaks/cheese-10-14/index.html

本文授權轉載自:
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GeneOnline 基因線上

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