又被蛋白純化折磨到哭泣,如果早知道這點就好了

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在做蛋白純化的時候,失敗總是難免的,要么蛋白無法表達,要么表達的蛋白檢測不到,還有就是蛋白無法掛柱……為了更好的幫助大家在蛋白純化領域一步到位,之前寫過一篇文章幫大家分析在哺乳動物表達系統中,親和標籤該如何選擇:

 

傳送門:哺乳動物細胞表達的難點和解決方案,都幫你整理好了

其中Strep-tag® 標籤(包含Strep-tag®II 或是Twin-Strep-tag®)搭配的Strep-tag® 純化系統,純化過程溫和、目標蛋白純度高,且相容於多種表達系統的特性,越發受到科研人員的歡迎。

 

優勢原理

第三代Strep-tag®蛋白純化系統,由Twin-Strep-tag®標籤搭配Strep-Tactin®XT 組合而成,相比於之前一代(Strep-tag®II:Strep-Tactin®),親和力接近共價,但連結仍為可逆,因此在溫和的純化流程中可以產出高純度(純度> 95%)、高產量的目標蛋白,且能保持目標蛋白活性。不僅如此,此系統在有表面活性劑的環境中仍有良好的純化表現,並且多次清洗柱子也不會造成目標蛋白流失, 即使是量少的蛋白或是膜蛋白,也有良好的純化效率。

圖 1

 

應用案例

在研究實例中,文章作者使用了 Strep-Tag®系統成功的重組表達和純化了乳膠清除蛋白(Latex Clearing Proteins, Lcps)1。 Lcp 是一種橡膠加氧酶,是僅有的被研究和生化表徵的三種胞外橡膠加氧酶之一2,可被革蘭氏陽性鏈黴菌屬K30(LcpK30)利用,在天然橡膠上生長。由於天然橡膠作為日用品被廣泛的使用,如密封袋,手套和輪胎等,產生的廢棄物也因此永久的進入了環境之中。其主要成分順-1,4 聚異戊二烯,可以被加氧酶裂解,反應生成的末端有醛、酮基的低聚類異戊二烯,可作為生物燃料或精細化學品的合成前體3。因此對橡膠加氧酶進行研究,具有十分重要的意義。

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下面我們對比一下 Strep-tag®II- LcpK30分別搭配 Strep-Tactin®high capacity 與 Strep-Tactin®XT 的純化效果。

圖2

 

以SDS-PAGE 分析發現(圖2),使用Strep-Tactin®high capacity 與Strep-Tactin®XT,均能得到大量高純度的蛋白;相對而言,使用Strep-Tactin®high capacity 在洗脫最後一步時會流失少量蛋白。而使用 Strep-Tactin®XT 則能避免蛋白的流失。因此,使用兩種樹脂的蛋白質得率是不同的(圖 3)。與 Strep-Tactin®high capacity 相比,Strep-Tactin®XT 可以多純化出約 13% 的 Strep-Tag®II-LcpK30,效率更高,價格更低。

圖3

 

與二代 Strep-Tactin®相比,由於三代 Strep-Tactin®XT 與 Strep-Tag®II 有較高親和力,可以讓更強烈的洗滌步驟得以進行,同時不會損失目標蛋白。因此,Strep-Tactin®XT 可在生理條件下獲得極高的蛋白質純度,其高親和力可以快速大量的純化Strep-Tag®II-LcpK30,溫和的洗脫條件又可以保持酶活性,為其三維晶體結構的成功測定提供了保障4。

不僅如此,Strep-Tactin®XT 還可用於變性條件下的純化,或WB/ELISA,偵測目標蛋白,還可用來固定目標蛋白,檢測蛋白質交互作用,或是更進一步用以篩選治療用蛋白質,工業用酵素等等,具有廣泛的應用領域。

 

參考文獻(向下滾動)

1. Röther W, Birke J, Grond S, et al. Production of functionalized oligo-isoprenoids by enzymatic cleavage of rubber. Microb Biotechnol 43: 1238–1433[J]. 2017.

2. Birke J, Röther W, Jendrossek D. RoxB is a novel type of rubber oxygenase that combines properties of rubber oxygenase RoxA and latex clearing protein (Lcp)[J]. Applied and environmental microbiology, 2017: AEM. 00721-17.

3.Birke J, Röther W, Schmitt G, et al. Functional identification of rubber oxygenase (RoxA) in soil and marine myxobacteria[J]. Applied and environmental microbiology, 2013: AEM. 02194-13.

4. Birke J, Röther W, Jendrossek D. Latex clearing protein (Lcp) of Streptomyces sp. K30 is a b-type cytochrome and differs from rubber oxygenase A (RoxA) in its biophysical properties[J]. Applied and environmental microbiology, 2015: AEM. 00275-15.

文章來源:iba

圖片來源:iba

題圖來源:站酷海洛

生物學霸

作者

生物學霸

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