一個PhD 的日常挑戰:怎樣找一個適合的細胞分選方法!

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猜想大家可能都有過這種經歷,導師要求你在實驗室建立一個新的實驗方法。

上個月的時候,我導師和我說,想找一個細胞分選的好方法,從人的全血裡做CD4 + T 細胞的基因功能研究。

看起來還挺簡單的,但搜了一下發現,市面上細胞分選的方法實在太多了……

所以到底哪個合適呢?

在看了幾個小時的paper後,我了解到,分選主要是根據所需細胞的屬性。對免疫細胞的劃分則是依據表面標誌CD分子。我組的研究,主要就針對CD4 + T細胞這一特定類群,表面含有CD45、CD3和CD4標記。而表達CD4就是輔助性T細胞的特徵。

最普遍的方法就是用特定抗體偶聯磁珠來捕獲細胞。細胞與磁珠結合後,再利用磁分離器來分選。但具體選用何種方法,還是要看下游的研究。由於我是想在選出的CD4 + T細胞上做基因功能研究,因此不能採用會影響靶細胞基因表達或者會激活細胞的方法,還得獲得大量高純度、高活力的細胞。

陰選是做基因研究廣為推薦的一種方法,間接的獲得目的細胞。通常目的細胞上沒有篩選標記。通過使用與所有非目的細胞結合的抗體混合物,將非目的細胞從樣品中去除,就留下目的細胞了。用磁分離器將無關細胞去除的這個方法其實不是很有效,因為一些沒與抗體結合的細胞會被結合的細胞一起連帶著選出去。因此,為了提高純度,分選步驟得重複好幾遍。所以陰選我暫不考慮,因為我最終要的細胞需要很純且不能受分選影響…

因為細胞表面上有CD4標記,也許可以陽選。陽選是直接將目的細胞特異性分選出來,並且幾乎不含非目的細胞。通常使用特定的抗體與磁珠偶聯,結合目的細胞。而在這種情況下,高親和力抗體被標記在細胞上,會對許多下游研究產生影響。有時,結合在細胞上的抗體和磁珠可以被二抗的加入而移除。或者,結合物有的時候會自然而然的分離。但大部分情況下,磁珠被保留在目的細胞上,可能會對細胞造成機械壓力。

能不能有一個方法把陰选和陽選的優勢都結合起來啊…

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後來在看到這篇paper 時,Mohr et al. (2018), 提到了一個叫「Fab-TACS」的技術,作者直接從全血中通過免疫親和層析來純化淋巴細胞,新穎又高效。

這個方法是來自德國的一家叫IBA Lifesciences 的公司,他們針對細胞分選有多種kits,而且包含我要做的CD4 + T 細胞。這個會不會就是我要找的呢?

查了一下,Fab-TACS  技術是指Fab-based Traceless Affinity Cell Selection,親和無痕細胞分選。在IBA獨家的Twin-Strep-tag ®  / Strep-Tactin ® 基礎上,運用免疫親和層析的原理,利用細胞表面抗原分子CD marker中的Fab片段,捕捉及釋放目標細胞。能次次精準的從全血、小鼠脾臟和單細胞組織懸液中選出不帶標籤,未經激活的細胞。

原理也很便於理解。Fab-TAC S 柱子填充有經Strep-Tactin ® 包被的細胞級瓊脂糖基質,能與含有Twin-Strep-tag的Fab片段結合。

接著,將全血或是血液樣本加入柱子,目的細胞就可以與Fab 片段結合了。非目的細胞被洗掉。

最後,加入生物素(biotin),因為biotin親和力較高,會中斷Fab片段與Strep-Tactin ® 的結合,此時Fab片段也同時脫離下來。Fab片段因親和力的降低,自發脫離細胞表面,無標記的目的細胞就到手啦!

4步操作,就可以直接從全血中分離細胞,這確實是非常簡單了。而且不涉及到磁珠的使用,也不用製備PBMC,因此實際上其實是可以省下很多時間的!當然,他們公司也提供有能進行自動分細胞分選的設備FABian ®

Fab-TACS  技術屬於陽選,可以得到非常純的CD4 +細胞,選出的細胞沒有標記,細胞表面無高親和力抗體或者磁珠。可以將幫助我進行基因研究而而且不影響CD4 +細胞的基因表達。

查了一下這個德國的IBA廠家後,發現他們在中國的代理商是達科為,諮詢後我了解到,如果想進行測試,可以嘗試一種Fab-TACS Gravity introductory kit,就是我們通常說的入門kit,而且現在正好有5折的活動!!這種性價比高的kit一直是實驗室採購的首選啊。於是我就直接訂了一個human CD4 + Fab標記的Fab-TA CS  Gravity introductory kit。

收到kit 後,我迫不及待開始了我的CD4 + 細胞分選。像之前了解的一樣,不用事先製備PBMC!另外操作步驟也像描述的那樣簡單,得到的數據如下:

01高得率

分選後,我的CD4細胞得率為99%,Fab-TACS厲害呀,這真是非常高了。

02高純度

為了測定細胞純度,我用CD3-APC / CD4-FITC 將細胞染色,上流式。死細胞以DAPI 染色先行排除,並使用不同FSC / SSC 信號來排除雙粘體和細胞碎片。結果顯示CD4 細胞的純度很高,僅有少量紅細胞污染!

03高活力

細胞的活力對於下游研究,尤其是那些長期的實驗是很重要的。Fab-TACS 的可逆性可以確保細胞的高活力和免疫活性,在我的測試中,細胞活率達到了99.6%。

拿著這些數據去找我的導師,他可以說是相當的滿意了!完全沒想到我能找到一個高效新穎,且性價比賊高的方法~所以po出這篇經驗來,也許可以幫助到在苦苦找方法,或者是同做細胞分選的實驗汪們。

文章來源:IBA
圖片來源:IBA、站酷海洛
題圖來源:站酷海洛
Image by Belova59 from Pixabay

生物學霸

作者

生物學霸

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